張 恒，俞 捷，岳 歡，羅 婭，李克彬，楊雪松，封校亞，許 潔

(1.遵義市第一人民醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563002； 2.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563099；3.遵義市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563002)

壬基酚(Nonylphenol, NP)是公認(rèn)的對(duì)機(jī)體具有毒性作用的環(huán)境雌激素，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),NP孕期暴露可影響仔鼠的神經(jīng)發(fā)射和學(xué)習(xí)記憶能力降低[1-3]，NP所致神經(jīng)毒性的機(jī)制目前尚不清楚。

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating-cel nuclear antigen,PCNA)是定位于細(xì)胞核內(nèi)的DNA修復(fù)相關(guān)蛋白，其表達(dá)的增強(qiáng)表明細(xì)胞正處在損傷修復(fù)或增生狀態(tài)[4]。本研究通過建立孕哺期暴露NP的仔鼠模型，觀察仔鼠斷乳期(21d)，兒童期(60d)腦組織皮質(zhì)部神經(jīng)元細(xì)胞PCNA的表達(dá)，并判斷NP暴露劑量與PCNA蛋白表達(dá)的相關(guān)性，初步探討NP引起認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 清潔級(jí)SD大鼠60只(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)20070005)，分為對(duì)照組、低、中、高劑量組(壬基酚50、100、200毫克/公斤/天組)，母鼠受孕第6天到出生后21 d染毒壬基酚。于仔鼠出生21 d、60 d取大腦皮質(zhì)組織制片檢查。

1.1.2 試劑 NP純度99%(東京化成株試會(huì)社)，一抗PCNA (北京中山生物試劑制品有限公司)；兔抗鼠PCNA多克隆抗體(北京中山生物試劑制品有限公司)；二抗羊抗兔(北京中杉金橋生物科技有限公司)；DAB顯色試劑盒(DAKO公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材 電熱恒溫水浴箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；101-2型電熱干燥箱(上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；SZ-93雙蒸水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；AL-104電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);普通光學(xué)/熒光顯微成像系統(tǒng)(德國徠卡公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化步驟 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片；二甲苯脫蠟；梯度酒精涮洗;蒸餾水沖洗；3%H202侵泡；檸檬酸鹽高壓修復(fù)；滴加30 μL動(dòng)物封閉血清液；滴加anti-PCNA一抗(1∶100)25 μL，4 ℃孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG；DAB顯色液顯色，自來水沖洗以終止顯色；蘇木素復(fù)染；梯度酒精涮洗；中性樹脂膠封片。

1.2.2 免疫組化圖象分析及判斷 每組內(nèi)每張大鼠腦切片在皮質(zhì)隨機(jī)挑選3個(gè)400倍視野進(jìn)行拍照。陽性部位定位于細(xì)胞核，其染色強(qiáng)度通過測(cè)量累積光密度值(Integral optical density，IOD)，IOD值越大，陽性表達(dá)越強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用單因素方差分析做差異比較，有差異者做q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，相關(guān)分析采用pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 PCNA蛋白表達(dá)的變化 各暴露組與對(duì)照組比較，仔鼠21、60 d皮質(zhì)部神經(jīng)細(xì)胞PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較多。高劑量組與中、低劑量組比較，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較多。隨著給藥劑量和給藥時(shí)間的增加，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。60 d各劑量組腦組織與21 d比較，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較多，強(qiáng)度增加。結(jié)果(見圖1～2)。

注：A、B、C、D分別代表對(duì)照組和低、中、高劑量組。 圖1 21 d仔鼠皮質(zhì)PCNA蛋白表達(dá)(×400)

注：A、B、C、D分別代表對(duì)照組和低、中、高劑量組。 圖2 60 d仔鼠皮質(zhì)PCNA蛋白表達(dá)(×400)

2.2 圖像分析數(shù)據(jù)顯示，孕鼠NP暴露后，與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組21、60d PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(F=476.34、1077.55，P<0.01)，光密度增高(F=44.46、7.58，P<0.01)隨著給藥劑量和給藥時(shí)間的增加，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，21、60d陽性細(xì)胞數(shù)與NP暴露劑量呈正相關(guān)(r=0.873、0.606，P<0.05)，結(jié)果(見表1)。

表1仔鼠皮質(zhì)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和灰度值差異比較

分組陽性細(xì)胞數(shù)21 d60 d灰度值21d60dC13.00±1.7712.25±3.01890362±261664 835730±133069 L29.12±3.44*79.87±3.48* 3791396±1448685*9537855±3853205 M56.62±3.62*98.87±4.48*10464333±4772021* 15413988±13291670*H78.12±5.64*119.75±4.80*15749976±2687923*17343043±6353555*F445.901077.5544.467.58P0.000.000.000.00

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating-cel nuclear antigen,PCNA)是一種重要的定位于細(xì)胞核內(nèi)的DNA修復(fù)相關(guān)蛋白，參與了多種DNA修復(fù)過程，如DNA的正常復(fù)制、堿基切除、核苷酸切除及錯(cuò)配切除等過程，故PCNA表達(dá)的增強(qiáng)或增多表明細(xì)胞正處在損傷修復(fù)和、或增生狀態(tài)，是一種可靠、穩(wěn)定的細(xì)胞增殖、修復(fù)標(biāo)記物[5]。NP引起皮質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)升高還是降低，這種變化在一定程度上可反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能變化。

幼年大鼠處于生長發(fā)育旺盛期，其腦皮質(zhì)內(nèi)存在一定數(shù)量的增殖細(xì)胞,這些細(xì)胞可能是神經(jīng)前體細(xì)胞，而成熟的神經(jīng)細(xì)胞則無增殖能力[6]。60 d的仔鼠逐漸進(jìn)入成熟期，隨著仔鼠腦組織神經(jīng)元的發(fā)育成熟，成熟的神經(jīng)元的比例相對(duì)21 d的仔鼠(幼年期)應(yīng)該比較高，PCNA陽性細(xì)胞的數(shù)量和累計(jì)光密度應(yīng)該略少于21 d，對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這種趨勢(shì)(成熟的神經(jīng)細(xì)胞無增殖能力，不表達(dá)PCNA)，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。

對(duì)于暴露組，21 d和60 d，隨著給藥劑量和給藥時(shí)間的增加，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，與NP暴露劑量呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠孕期NP暴露后，致仔鼠較多的皮質(zhì)細(xì)胞處在增生狀態(tài)，推測(cè)可能是NP對(duì)腦組織損傷的修復(fù)反應(yīng)。皮質(zhì)部細(xì)胞由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞兩大類組成，其中90%的細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞。對(duì)于數(shù)量占大多數(shù)的膠質(zhì)細(xì)胞，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目與NP暴露劑量和時(shí)間呈正相關(guān)。暴露NP導(dǎo)致較多膠質(zhì)細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。對(duì)于神經(jīng)元，NP可能影響了神經(jīng)前體細(xì)胞向成熟的神經(jīng)元的發(fā)育，PCNA在非增殖細(xì)胞中的表達(dá)代表其參與了DNA修復(fù)[7]，即這些PCNA陽性表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞處于增生狀態(tài)。NP的毒性作用對(duì)機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞造成了損傷，隨后可能啟動(dòng)了損傷修復(fù)或增生過程，神經(jīng)元反應(yīng)性增殖，并可進(jìn)一步誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的增生。尤其對(duì)于暴露組60d的仔鼠，進(jìn)入成熟期皮質(zhì)本應(yīng)以PCNA陰性的成熟細(xì)胞為主，但在NP的作用下皮質(zhì)細(xì)胞廣泛表達(dá)PCNA，證明其明顯處于增殖狀態(tài)，可能與機(jī)體的損傷修復(fù)反應(yīng)有關(guān)，間接反映了NP持續(xù)的神經(jīng)毒性作用。

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