謝星光,陳 晏,卜元卿,戴傳超,*

(1. 南京師范大學生命科學學院，江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室，南京 210023； 2. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042)

酚酸類物質(zhì)的化感作用研究進展

謝星光1,陳 晏1,卜元卿2,戴傳超1,*

(1. 南京師范大學生命科學學院，江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室，南京 210023； 2. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042)

酚酸類物質(zhì)是普遍存在于高等植物組織并與植物生長密切相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物。幾十年來，人們對酚酸類化合物的認識逐漸加深，但關(guān)于其在生物學、生態(tài)學以及農(nóng)業(yè)上的作用機制仍不是很清楚。因此，進一步了解這些生物分子將有助于生態(tài)系統(tǒng)的維持與保護。重點介紹了酚酸類物質(zhì)的來源及化感作用，微生物對酚酸類物質(zhì)的降解機理，代謝途徑及相應(yīng)分子水平的研究，指出了酚酸類物質(zhì)研究中存在的問題，同時展望了酚酸類物質(zhì)的研究方向與前景。

酚酸；化感物質(zhì)；化感作用；生物降解；微生物；分子水平

1937年德國科學家Molish首次提出化感作用一詞，并將其定義為所有植物(含微生物)之間的相互作用。之后，酚酸類物質(zhì)作為植物促生、抗脅迫、色素、防御分子、信號分子和化感物質(zhì)的研究逐漸引起人們的關(guān)注[1]。近年來，酚酸被證明具有較強化感活性的研究卻越來越多，并且已取得業(yè)內(nèi)學者的一致認可[2- 5]。酚酸通常為芳香環(huán)上帶有活性羧基的有機酸，是引起植物自毒作用的主要原因。許多研究表明，酚酸類物質(zhì)能夠通過多種途徑對植物產(chǎn)生影響[6- 8]。隨著世界人口增加、糧食及經(jīng)濟作物生產(chǎn)壓力增大，植物化感作用已引起世界各國的關(guān)注。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，酚酸作為化感物質(zhì)對次年作物生長和土壤活性具有破壞性的影響[9- 10]。在森林生態(tài)系統(tǒng)，酚酸類物質(zhì)可能作為入侵植物參與競爭的直接或間接手段[11- 12]，提供競爭優(yōu)勢。筆者就當前酚酸作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)化感物質(zhì)的研究趨勢，在前人研究的基礎(chǔ)上，主要從酚酸類物質(zhì)的來源與作用機理、微生物對酚酸類物質(zhì)的代謝機制、相應(yīng)分子水平研究及其研究中存在的問題這四個方面來介紹酚酸類物質(zhì)的研究進展。同時，就目前研究筆者推測，酚酸類物質(zhì)可能是造成作物連作障礙與生態(tài)群落演替的相關(guān)因子，并且植物內(nèi)生菌在其中可能扮演著重要的角色。

1 酚酸類物質(zhì)的來源及其影響

1.1 酚酸類物質(zhì)的生物合成及其釋放途徑

植物通過分泌小分子次級代謝產(chǎn)物來響應(yīng)生物和非生物脅迫，這些代謝產(chǎn)物通常來自異丙醇、苯丙烷、生物堿或是脂肪酸途徑[13]。酚酸類物質(zhì)的生物合成主要通過莽草酸或丙二酸途徑。在植物內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌的參與下，莽草酸介導的酚酸合成前體主要來自于糖酵解的簡單碳水化合物和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的芳香氨基酸，苯丙氨基酸和色氨酸。與真菌、細菌相比，高等植物較少利用丙二酸途徑合成酚酸類物質(zhì)[14]。圖1概括了酚酸類物質(zhì)主要的生物合成途徑。

自然條件下酚酸類物質(zhì)必須通過合適的途徑才能進入到環(huán)境中，其釋放途徑是產(chǎn)生化感作用的重要環(huán)節(jié)，主要包括以下幾條途徑：(1)植物根系分泌：新根和未木質(zhì)化的根是分泌這些物質(zhì)的主要場所，研究表明多種作物根系可以分泌酚酸類物質(zhì)[15- 19]。(2)植物殘體和凋落物的降解：植物的枝、葉、花、果實殘體在土壤中分解產(chǎn)生酚酸類物質(zhì)，已有大量關(guān)于作物腐解產(chǎn)生酚酸類物質(zhì)的研究[20- 21]。(3)植物向體外釋放酚酸物質(zhì)：劉春香等[22]分析了新鮮黃瓜的揮發(fā)性成分驗證這一來源。(4)雨霧從植物表面淋溶：雨霧淋溶是自然界酚酸進入環(huán)境的主要方式之一[23]。在干旱和半干旱條件下，植物的活體部分或是凋落物通過釋放和分解產(chǎn)生具有揮發(fā)性的化感物質(zhì)。當雨量充沛或高濕度條件時，一些酚酸類物質(zhì)通過雨霧、淋溶從植物表面轉(zhuǎn)移到土壤中進而產(chǎn)生化感活性，這在土壤中就很難分辨此種酚酸類物質(zhì)是植物揮發(fā)產(chǎn)生還是土壤微生物作用產(chǎn)生。(5)花粉傳播：孫庚[24]指出瑞香狼毒花粉的浸提液對周圍物種的有性繁殖產(chǎn)生抑制作用。推測自然條件下酚酸類物質(zhì)也有可能通過此途徑釋放。(6)土壤微生物作用：土壤中微生物可以利用酚酸作為碳源和能量[25]，在限制性條件下酚酸可為固氮菌提供碳源[26]。土壤微生物是酚酸化感活性能否表現(xiàn)的決定因素，也就是說微生物既能降低也可以放大酚酸的毒性。

圖1 酚酸生物合成途徑概括Fig.1 Summarized phenolic acids biosynthetic pathway[14]

1.2 酚酸類物質(zhì)的化感作用

1.2.1 酚酸類物質(zhì)對種子萌發(fā)與植株生長的影響

酚酸類物質(zhì)影響作物生長發(fā)育的典型表現(xiàn)為抑制種子的萌發(fā)，其主要原因是抑制種子萌發(fā)所需的關(guān)鍵酶類。柚木葉浸提液中酚酸類物質(zhì)對莎草種子的發(fā)芽具有顯著影響[27]。Yan等[28]從Merremiaumbellatasubsp.orientalis分離出8種酚酸，結(jié)果表明這八種酚酸對擬南芥種子萌發(fā)具有較強的抑制活性。對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸對花生發(fā)芽有顯著的影響，這種影響效應(yīng)與酚酸物質(zhì)的種類及濃度有關(guān)[29]。

現(xiàn)已證明酚酸類物質(zhì)對植物生長有抑制作用。當香豆酸的濃度≥0.25 mmol/L時，可以顯著中斷大豆根的伸長[30]。酚酸類物質(zhì)對花生幼苗地下部的干鮮重均表現(xiàn)出“低促高抑”的特點[29]。在自然界中，?？吹睫ь惷⒌牡胤?jīng)]有其它草本植物的生長，主要原因是蕨類枯死枝葉中含有阿魏酸和咖啡酸等酚酸類物質(zhì)，雨水沖刷后到土壤中進而抑制其它植物的生長[31]。

1.2.2 酚酸類物質(zhì)對土壤微生物活性的影響

Blum[32]指出，土壤微生物類群分布與土壤酚酸的種類和濃度以及無機養(yǎng)分有一定的關(guān)系。另外，Sparling等[33]認為人為添加酚酸可以改變土壤微生物量和活性。酚酸類物質(zhì)與土壤微生物活性變化有著密切的關(guān)系，通過改變土壤的理化性質(zhì)，促進一些微生物生長的同時也抑制其它一些相應(yīng)土壤微生物的活性。Qu等[34]研究表明酚酸類物質(zhì)可以顯著的影響土壤中微生物的生物量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)，選擇性的增強土壤中特殊的微生物種類。研究指出地黃(Rehmanniaglutinosa)連作兩年后土壤總酚酸含量與對照相比顯著增加，同時運用宏蛋白質(zhì)組學系統(tǒng)鑒定了連續(xù)種植體系中根際土壤不同蛋白的表達量，結(jié)果表明地黃連續(xù)種植導致根際酚酸類物質(zhì)積累進而引起土壤微生物生態(tài)環(huán)境的改變[35- 36]。隨著花生連作年限的增加，土壤中對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸含量增加，但土壤花生根際細菌和放線菌的數(shù)量明顯減少，真菌數(shù)量增多，土壤微生物區(qū)系發(fā)生改變[29]。西瓜根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)可以促進尖孢鐮刀菌孢子的形成和萌發(fā)，而水稻根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)能抑制尖孢鐮刀菌孢子的形成和萌發(fā)[37]。

1.2.3 酚酸類物質(zhì)對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響

近年來，無論是糧食、油料、蔬菜、藥材、還是園藝植物，連作障礙越來越引起人們的關(guān)注，連作障礙使植物產(chǎn)量下降，抗逆性降低，其中酚酸類物質(zhì)在土壤中積累是引起作物連作障礙的主要原因[38]。不同種類植物連作，分泌酚酸的種類和數(shù)量存在差異，因而對土壤條件和微生物群落結(jié)構(gòu)影響不同，并且連作土壤微生物區(qū)系變化與酚酸類物質(zhì)有著極其密切的關(guān)系。

對植物直接毒害：酚酸類物質(zhì)通過影響細胞膜的通透性、礦質(zhì)元素吸收、光合作用、植物激素、蛋白質(zhì)和DNA合成等多種途徑來影響植物生長。Hao等[39]研究表明，阿魏酸是西瓜根系分泌物的主要成分，其根系分泌物對西瓜和萵苣幼苗有顯著的抑制作用，并且這種作用隨著根系分泌物濃度的增加而增大。黃瓜根系分泌物中含有苯甲酸、對羥基苯甲酸等10種毒性化感物質(zhì)，當黃瓜根系分泌酚酸達到一定濃度時就會抑制黃瓜生長[6]。水培添加阿魏酸、香草酸、香草醛和對羥基苯甲酸，研究4種酚酸對地黃生長的影響，結(jié)果表明，經(jīng)過酚酸處理，地黃幼苗SOD(超氧化物歧化酶)和POD(過氧化物酶)活性先升高后下降，MDA(丙二醛)含量升高，抑制地黃生長，推測酚酸可能是造成地黃連作障礙的潛在物質(zhì)[40]。

對植物間接毒害：植物生長發(fā)育既受控于內(nèi)部信號，又取決于土壤提供充足的礦質(zhì)營養(yǎng)。因此，在許多環(huán)境下，土壤可用的營養(yǎng)元素是約束植物生長的關(guān)鍵因素[41]。目前已經(jīng)認可，土壤養(yǎng)分與化感效應(yīng)之間存在相互關(guān)系。Baziramakenga等[42]指出酚酸類化感物質(zhì)可以顯著干擾大豆對P、K、Mg、Mn等礦質(zhì)元素的吸收，并且降低植株根和莖的生物量。王興祥等[38]在研究江西紅壤時指出：花生連作酚酸積累從而導致土壤偏酸，造成病原真菌數(shù)量增加，進而改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，抑制花生生長，增加發(fā)病率。土壤中肉桂酸和香草醛的濃度隨著茄子連作年限的增加而增多，當肉桂酸和香草醛的濃度分別為1 mmol/L和4 mmol/L時會促進茄子枯萎病的發(fā)生，增加病原菌的侵染。因此，高濃度的肉桂酸和香草醛增加了茄子的自毒作用和感染疾病的風險[43]。同時，有學者證明酚酸與土壤貧瘠有關(guān)[38]。

2 酚酸類物質(zhì)化感作用機制

2.1 酚酸類物質(zhì)間的互作效應(yīng)

研究表明酚酸類物質(zhì)的化感潛力是所有酚酸綜合作用的結(jié)果[44- 45]。Olofsdotter等[46]指出，植物在自然狀態(tài)下釋放酚酸類物質(zhì)的濃度尚不能起到抑草作用，而化感抑草效果則是由包括酚酸類物質(zhì)在內(nèi)的所有化感物質(zhì)間的互作效應(yīng)引起的。Rimando等[47]研究表明，水稻根系浸提物中的化感活性成分基本上都是酚酸類物質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)任何單一成分的酚酸其作用潛力都無法合理解釋水稻田間的抑草效果，這些結(jié)果都暗示著酚酸類物質(zhì)間存在著互作效應(yīng)。何華勤等[44]在探究幾種酚酸類物質(zhì)的互作效應(yīng)時指出，酚酸類物質(zhì)間的增效或拮抗的互作效應(yīng)與各因子在化合物中的濃度水平密切相關(guān)，如水楊酸在濃度<0.14 mmol/L時，對對羥基苯甲酸表現(xiàn)增效作用，當濃度>0.14 mmol/L時則表現(xiàn)為拮抗作用。并且在一定范圍內(nèi)，水楊酸對肉桂酸都有拮抗作用，而肉桂酸在濃度為0.14 mmol/L時對水楊酸表現(xiàn)出拮抗作用，同時指出香草酸與肉桂酸的作用效果都是增效的。由此表明，自然界中酚酸所展現(xiàn)的化感作用是多種酚酸相互作用的共同結(jié)果。

2.2 酚酸類物質(zhì)影響植物生理的作用機制

圖2 酚酸類物質(zhì)作用機制[49]Fig.2 Mechanism of phenolic acids[49]

3 微生物對酚酸類物質(zhì)的降解及分子機理研究

3.1 微生物對酚酸類物質(zhì)的降解

自然條件下，酚酸類物質(zhì)進入到土壤以后，在土壤吸附作用下會形成3種形態(tài)：完全束縛態(tài)，可逆束縛態(tài)和自由態(tài)，其中可逆束縛態(tài)和自由態(tài)在土壤中才是真正具有化感活性的化感物質(zhì)，因為酚酸類物質(zhì)在閾值范圍內(nèi)并不能產(chǎn)生化感活性，必須積累到一定水平才能對目標植物產(chǎn)生毒性。Dalton等[60]指出土壤對酚酸的可逆吸收，可能是酚酸逃避微生物降解的有效措施，因為游離酚酸在大多數(shù)土壤中存在時間較短，Dalton還假設(shè)土壤對酚酸的“保護”有利于酚酸在土壤中積累到有毒水平。同時當酚酸類物質(zhì)進入到環(huán)境以后，其保留時間、被利用情況和化感活性都會受到微生物的影響。許多情況下，土壤中微生物降解或者轉(zhuǎn)化酚酸決定著其化感作用的存在方式與表達[61]。另外，特殊的微生物群體可以降解酚酸使其失去化感活性，通常情況下被認為是土壤的自我解毒功能。但是在某些情況下，酚酸降解產(chǎn)物的化感活性可能會變得更強，因此，這往往是檢測土壤中酚酸類化感物質(zhì)持續(xù)性和毒性的難題。

在特異性酶參與下，微生物降解酚酸類物質(zhì)在苯環(huán)斷裂時一般具有相似的3種代謝途徑，一條途徑是鄰苯二酚2，3-雙加氧酶途徑，即間位裂解途徑。另一條途徑是由鄰苯二酚1，2雙加氧酶起始反應(yīng)的，即鄰位裂解反應(yīng)。還有一條途徑是龍膽酸代謝途徑。

幾十年來，研究者們已分離到多種能降解酚酸類物質(zhì)的微生物，這些微生物主要包括：(1)外界環(huán)境微生物：如假單胞菌(Pseudomonassp.)、醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、紅球菌(Rhodococcus)、根瘤菌(Rhizobia)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、芽孢桿菌(Bacillus)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepaciaps)、白腐真菌(Phanerochaete)、黃孢原毛平革菌(Phanerochetechrysosporium)、頭孢霉屬(Cephalosporium)、青霉菌(Penicillium)、鏈霉菌(Streptomyces)、假絲酵母菌(Candida)等；(2)內(nèi)生菌類：擬莖點霉(Phomopsis)、支頂孢屬(Acremoniumsp.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)等(3)腸道微生物：酪黃腸球菌(Enterococcuscasseliavus)、狄氏擬桿菌(Bacteroidesdistasonis)、糞腸球菌(EnterococcusfaecalisPDG- 1)、遲緩埃格特菌(Eggerthellalenta)、消化鏈球菌(Peptostreptococcussp. SDG- 1)等。

外界環(huán)境微生物作用：一方面是從環(huán)境中篩選具有酚酸降解特性的微生物。Zhang等[62]用香豆酸作為唯一碳源從土壤中分離出4種微生物，結(jié)果表明這4種微生物對香豆酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸有高效的降解作用。目前報道只有假單胞菌屬可以利用沒食子酸作為唯一碳源生長[63]；另一方面是通過微生物手段對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展提供保護。土壤中酚酸類物質(zhì)的積累是作物產(chǎn)生自毒作用的主要原因。李華煒等[64]在探索連作障礙中酚酸類物質(zhì)的生物降解時發(fā)現(xiàn)，黃孢原毛平革菌分泌的胞外酶系對香草酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸有顯著的降解功能，黃孢原毛平革菌與3種酚酸培養(yǎng)3d后，這3種酚酸的平均降解率分別為98.39%、97.88%和58.20%。徐淑霞等[65]將黃孢原毛平革菌制成菌劑施入連作7a的黃瓜土壤中，土壤中這3種酚酸含量都有所降低，降解率為54.46%。為此，選擇特定的微生物對酚酸積累污染地區(qū)的生態(tài)保護和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

植物內(nèi)生菌作用：本文將植物內(nèi)生菌定義為植物內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌的總稱。因為，目前關(guān)于內(nèi)生菌降解酚酸的報道較少，筆者就本課題組的研究提出可能存在爭議的看法。本課題組先前從重陽木莖內(nèi)皮分離到1株內(nèi)生真菌Phomopsisliquidambari。發(fā)現(xiàn)其在體外環(huán)境下，可以利用4-羥基苯甲酸作為唯一碳源和能量生長，并且最大降解率達到99%[66]。同時在土壤中對Phomopsisliquidambari進行跟蹤，我們發(fā)現(xiàn)其在土壤中可以存活30 d之久，并且可以明顯加快土壤中凋落物的降解[67]，這與前人研究一致[68- 69]。土壤中酚酸類物質(zhì)大部分來源于木質(zhì)素的分解。因此我們推測，內(nèi)生菌普遍存在于植物組織中，剛掉落的植物凋落物中含有大量的內(nèi)生菌，凋落物脫離植物落到地表也伴隨著植物內(nèi)生菌脫離宿主進入土壤環(huán)境，部分內(nèi)生菌在土壤中進行營腐生生活，勢必可能會利用酚酸類化感物質(zhì)作為能源生長。藥用植物含有大量活性成分，但其內(nèi)部內(nèi)生菌群也十分豐富，一方面內(nèi)生菌群在藥用植物體內(nèi)必須忍耐高濃度的藥物成分，另一方面推測這些內(nèi)生菌群也有可能介導活性化合物的合成與分解機制。茅蒼術(shù)是江蘇省道地藥材，其體內(nèi)積累大量揮發(fā)性藥物成分，同時茅蒼術(shù)體內(nèi)含有與擬莖點霉屬相似的菌群。當茅蒼術(shù)凋落物進入土壤，一方面內(nèi)生菌群可能調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系發(fā)生改變，另一方面內(nèi)生菌群可能有選擇的在土壤中分解小分子有機酸。因此，設(shè)計實驗，茅蒼術(shù)與花生間作同時添加內(nèi)生真菌，并取得顯著效果[70]。近期還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌Phomopsisliquidambari在凋落物存在下對吲哚的降解率達到99.1%[71]。這些研究結(jié)果將為內(nèi)生菌在體外緩解作物連作障礙及降解含氮雜環(huán)等污染物提供新的視角。

腸道微生物作用：酚酸，廣泛存在于食物中，特別是在水果、蔬菜和飲品(咖啡、啤酒、白酒和果酒)[72]。曾報道根據(jù)飲食習慣不同，人每天攝入的酚酸量大約為200 mg。近年來，人們對酚酸越來越重視，主要原因是其在食物中有較高的濃度、較強的生物學特性，并且容易被腸道吸收[73]。腸道中存在著多樣的酚酸降解菌群。因為腸道菌群存在于特殊的厭氧環(huán)境，目前較難在外界環(huán)境中應(yīng)用，但是其作為一類潛在的研究對象已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注。在這里，我們有必要關(guān)于腸道微生物對酚酸的降解進行簡單概述：腸道中的酚酸主要來源于黃酮類裂解和食物釋放。Couteau等[74]在厭氧條件下通過含有綠原酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選腸道細菌，結(jié)果表明，篩選的腸道細菌包括很多已經(jīng)鑒定的細菌，并在人類的腸道內(nèi)可以大量水解綠原酸。另外，腸道酯酶在酯化酚酸裂解中扮演著重要角色。在腸道菌群作用下咖啡酸大量減少，并產(chǎn)生大量4-乙基鄰苯二酚。阿魏酸通過腸道細菌代謝生成3-羥基苯丙酸，但隨后代謝情況目前仍不清楚[75]。

3.2 微生物對酚酸類物質(zhì)降解的分子機理

就目前而言，國內(nèi)外在研究酚酸類物質(zhì)降解上多數(shù)只局限于對高效降解菌株的篩選，研究較多的是多種微生物對酚酸類物質(zhì)降解率的作用。很少有關(guān)于微生物降解酚酸類物質(zhì)的關(guān)鍵基因與關(guān)鍵酶的作用的報道。對于土壤中酚酸類物質(zhì)降解是特定微生物區(qū)系的共同作用，每種酚酸都通過特定的代謝途徑進行降解，關(guān)于土壤中降解酚酸類物質(zhì)微生物基因的多樣性和降解關(guān)建酶基因的微生物來源也很少有人報道。

酚酸降解酶研究：小分子酚酸降解途徑通常涉及到酚酸脫羧酶、羥化酶和加氧酶的共同作用。脫羧酶的作用主要使小分子酚酸脫羧生成乙烯基鄰苯二酚、乙烯基苯酚、乙烯基愈創(chuàng)木酚和鄰苯二酚等代謝產(chǎn)物[76]。在已報道的研究中，乙烯基較不穩(wěn)定，通常在加氧酶的作用下直接被氧化成醛基，緊接著氧化成羧基，苯環(huán)上有甲氧基的會脫去甲基變成羥基，最終生成類似于原兒茶酸的中間代謝產(chǎn)物[77]。接著在微生物作用下，原兒茶酸脫羧成鄰苯二酚。再選擇性通過上述兩條加氧酶途徑進行開環(huán)，產(chǎn)物進入三羧酸循環(huán)等代謝途徑[66]。上述多種酶系催化的反應(yīng)詳細步驟只在某些酚酸上發(fā)生，但是微生物對任何酚酸物質(zhì)的降解都是在不同的時間里通過表達不同酶類進行調(diào)控的。

酚酸降解基因研究：自然界酚酸類物質(zhì)能否被完全降解，大部分主要取決于苯環(huán)斷裂的難易程度。目前關(guān)于酚酸苯環(huán)直接裂解的研究未見報道，但是在微生物作用下多數(shù)酚酸都會轉(zhuǎn)化成苯酚類中間代謝產(chǎn)物。因此，探究苯酚降解關(guān)鍵酶和關(guān)鍵基因的調(diào)控與表達對酚酸降解基因的研究具有至關(guān)重要的作用。好氧菌將苯酚及其衍生物氧化為鄰苯二酚的單加氧酶是苯酚羥化酶，它是苯酚降解的一個關(guān)鍵酶。迄今為止，已克隆多組分苯酚羥化酶基因簇。如ComamonastestosteroniTA44l菌中苯酚降解基因簇aphKLMNOPQBCEFGHJI，其中aphKLMNOPQB編碼苯酚羥化酶基因和間位裂解酶鄰苯二酚2，3-雙加氧酶，aphCEFGHJI編碼間位代謝途徑[78]。AcinetobactercalcoaceticusPHEA- 2的苯酚羥化酶基因簇mphKLMNOP，下游為編碼苯甲酸降解途徑相關(guān)酶的基因簇[79]。并且一般情況下，苯酚降解基因簇結(jié)構(gòu)上高度保守，苯酚羥化酶一般都由6個亞基組成，分別有苯酚降解基因的KLMNOP基因編碼。研究指出，苯酚羥化酶基因均受基因調(diào)控表達，并且這些調(diào)控基因編碼的調(diào)控蛋白都屬于XylR/DmpR調(diào)控蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)的苯酚降解正調(diào)控基因大約有10個。

現(xiàn)階段研究中，也有學者對酚酸降解途徑的關(guān)鍵酶進行純化、分析，并對關(guān)鍵酶基因進行克隆、定位和表達。Huang等[80]從Candidaguilliermondii純化出酚酸脫羧酶，并指出酶的分子量為20 KDa，是一種二聚體脫羧酶，在Mg2+的刺激下具有更強的活性。通過對Enterobactersp. Px6- 4中 FADase(阿魏酸脫羧酶)基因在大腸桿菌中的克隆、測序和表達，Gu等[81]指出編碼 FADase 的基因(fad)有507個氨基酸組成，編碼蛋白有168個氨基酸殘基組成。并且轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 PadR 位于fad基因的上游。高曉莉等[82]在探究酚酸類物質(zhì)的龍膽酸降解途徑時指出，編碼代謝3-羥基苯甲酸至丙酮酸的基因已被定位8 kb的DNA片段上，并且可以高效表達以及產(chǎn)生相應(yīng)的酶活。Yoshida等[83]在好氧細菌Rhizobiumsp. strain MTP- 10005中鑒定出龍膽酸代謝途徑所涉及的基因簇。這個基因簇由graRDAFCBEK基因、graA、graB、graC和graD組成。酶學研究表明，graD、graA、graC和graB主要編碼間苯三酚羥化酶(EC 1.14.13.x)中的還原酶(GraD)和加氧酶(GraA)部分，以及編碼 maleylacetate 還原酶(GraC)(EC 1.3.1.32)和偏苯三酚1，2-雙加氧酶(GraB)(EC 1.13.11.37)。生物信息學分析表明graE，graR和graK基因主要編碼一個未知功能蛋白(GraE)，一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(GraR)和一個苯甲酸鹽運輸?shù)鞍?GraK)。對龍膽酸脫羧酶基因graF進行定量PCR，探究以龍膽酸作為唯一碳源條件下其mRNA的最大表達量。基因graDAFCBE反轉(zhuǎn)錄PCR表明這些基因簇轉(zhuǎn)錄單個mRNA分子，并且其基因的表達主要受龍膽酸誘導。Chen 等[66]指出內(nèi)生真菌B3在降解4-羥基苯甲酸時，4-羥基苯甲酸羥化酶，3，4-二羥基苯甲酸脫羧酶，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶都是降解代謝所需的關(guān)鍵酶。

酚酸類物質(zhì)的降解需要復雜酶系的共同作用，每一種酶在降解途徑中都有特定的功能，在目前的研究中對多種酚酸降解酶如羥化酶、加氧酶、脫羧酶等基因克隆與表達已有較多的研究，并對降解途徑基因簇的分析也越來越變得詳細。國內(nèi)外的研究已經(jīng)深入到雙加氧酶的結(jié)構(gòu)與功能研究、相關(guān)基因的起源于改造、定量與表達、反應(yīng)機理的研究等。但是就目前科學水平而言，通過分子手段在基因或者酶水平上來說清楚酚酸類物質(zhì)降解的每一個細節(jié)比較困難，尤其是對于大田試驗來說，酚酸類物質(zhì)降解是微生物的多重作用，又因為降解酚酸的基因大多數(shù)是位于細菌染色體之外的質(zhì)粒上，由于質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移或是遺傳元件的轉(zhuǎn)移機制等，使得探究降解基因的確切來源仍是不嚴格的，因此現(xiàn)階段對于酚酸降解微生物多樣性研究以及降解基因的的微生物來源仍是比較棘手的問題。

4 酚酸類物質(zhì)研究存在的問題

4.1 酚酸類物質(zhì)是否為化感物質(zhì)

多年來，酚酸類物質(zhì)是否為化感物質(zhì)一直被質(zhì)疑。主要因為田間條件下酚酸類物質(zhì)的濃度要顯著低于實驗室條件下抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的濃度。舉個例子，在實驗室條件下抑制牽牛花幼苗生物量的20%，需要對香豆酸的濃度為0.13 μmol/g土壤，但是目前已知在田間條件下對香豆酸的最大濃度<0.03 μmol/g土壤[84]。有學者認為土壤中游離酚酸含量很低，在土壤中半衰期較短，土壤較強的吸附作用迫使酚酸直接作用減弱[85]。Olofsdotter等[46]指出酚酸通常被認為是假定的化感物質(zhì)，并且水稻所釋放的單一酚酸類物質(zhì)的濃度不足以起到化感抑草的作用。實際上，實驗室條件下主要探究的是單一酚酸的化感作用，但是當復合酚酸作用時對植物的影響更大[29]。因此，本人認為酚酸類物質(zhì)為化感物質(zhì)并具有較強的化感活性，只是在田間條件下很難采取有效的措施確定其化感作用濃度，使得很多學者對酚酸是否為化感物質(zhì)產(chǎn)生懷疑。

4.2 酚酸類物質(zhì)研究面臨的困難

酚酸類物質(zhì)的應(yīng)用研究具有很大的潛能，但在土壤中的轉(zhuǎn)化卻存在著復雜性。因此，對其研究還存在著許多困難。一般認為酚酸類物質(zhì)從植物分泌之后，在土壤中經(jīng)過物理過程和化學過程的變化，在此期間還可能會受到土壤微生物的多重作用，因此對于多種酚酸類物質(zhì)難以辨別是植物最初分泌出來的還是受到土壤微生物作用轉(zhuǎn)化而來的。實驗室條件下對于酚酸類物質(zhì)的研究相對比較容易，但大田環(huán)境下的實驗卻存在著眾多困難，因為大田實驗中面臨的是眾多不確定的因素以及環(huán)境因子的干擾。我們知道酚酸類物質(zhì)除具有化感作用外還具有其它的一些作用，這就很難辨別其專一效應(yīng)與非專一性效應(yīng)，如多種植物可以分泌一些酸類物質(zhì)，這些酸類物質(zhì)大多是有利于對無機營養(yǎng)物質(zhì)以及微量元素的吸收，如果像其它實驗一樣，將這些酸類物質(zhì)作用于植物可能會產(chǎn)生化感作用而將其分為化感物質(zhì)，這樣做顯然是不正確的，因為大多數(shù)酸類物質(zhì)都可以抑制植物的生長。作物產(chǎn)生的酚酸類物質(zhì)雖然具有抑制雜草的作用，但是我們也發(fā)現(xiàn)這些酚酸類物質(zhì)同樣對作物產(chǎn)生抑制作用，這樣就限制了酚酸類物質(zhì)的全面應(yīng)用。作物在不同的發(fā)育階段產(chǎn)生的酚酸種類和濃度都不相同，高濃度的酚酸類物質(zhì)對作物產(chǎn)生抑制，但是在某一濃度下酚酸類物質(zhì)對于植物的生長有促進作用，實際應(yīng)用中對這一臨界值的控制比較困難。同時多種酚酸之間的互作效應(yīng)使得對其化感活性的研究變得更加困難。Rice曾指出有些化感物質(zhì)的作用不具有直接性，這種特點稱為隱蔽性，這些化感物質(zhì)可能與土壤中微生物交織在一起，通過潛在的病原菌或是腐生動物發(fā)揮其作用。對于土壤生態(tài)系統(tǒng)而言，化感作用受微生物基因型的影響也很大，土壤中復雜的基因多樣性對于研究關(guān)鍵基因的作用也比較困難。

5 展望

在今后的研究中，酚酸類物質(zhì)的研究將向多方向發(fā)展，但最基本的仍是繼續(xù)尋找植物產(chǎn)生的酚酸類化感物質(zhì)，并且鑒定、純化，探究這些次級代謝產(chǎn)物的特性，是否對植物具有專一性，采用同位素標記方法，追蹤其在生物體內(nèi)的合成途徑、自然環(huán)境中存在狀態(tài)以及與受體植物、微生物和生態(tài)系統(tǒng)相互作用的整個過程?，F(xiàn)階段分離和鑒定新的酚酸類物質(zhì)仍是一個重要的方面，因為酚酸類物質(zhì)不僅可以指導農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而且具有廣泛的應(yīng)用價值，例如作為殺蟲劑、食品添加劑、信號分子、防御分子以及人體抗氧化劑[14,74,86],但事實上在已確定的酚酸類物質(zhì)中真正具有應(yīng)用價值的很少，所以鑒定新的酚酸類物質(zhì)并探索其潛在的應(yīng)用價值具有重要的作用。目前，實驗室中酚酸類物質(zhì)的研究多數(shù)還只局限于單一因素作用于受試植物，而自然環(huán)境中是多種物質(zhì)混合在一起，多種物質(zhì)之間存在著復雜相互轉(zhuǎn)化的過程，在未來的研究中需要探索酚酸類物質(zhì)釋放到土壤中后期受到環(huán)境產(chǎn)生的影響，并且對酚酸類物質(zhì)的基因調(diào)控、產(chǎn)生、釋放及作用機制做進一步探討。同時研究酚酸類物質(zhì)的化感活性一定要將植物釋放的酚酸種類和數(shù)量同時考慮，尤其要注意酚酸類化感物質(zhì)之間的協(xié)同、拮抗和加和等相互作用。

連作障礙機理的研究，是農(nóng)業(yè)生態(tài)文明建設(shè)可持續(xù)生產(chǎn)的熱點之一?，F(xiàn)階段連作障礙各因子間的相互關(guān)系等問題也將是今后研究的新熱點。在此，我們提出自己的一些想法：我們通常可以看到自然界很多野草每年在同一片地方都生長的很茂盛，完全沒有“連作障礙”的趨勢，這不禁讓我們思考其中的原由是什么？對此，依據(jù)本課題組的研究我們推測這可能與植物固有的內(nèi)生菌群有關(guān)，正是自然界植物中含有特性的內(nèi)生菌群，才使植物免受“連作障礙”的干擾。Zhao等[87]指出，脫落酸(ABA)隨著種群的演替逐漸積累。早期演替的植物對ABA的敏感性會引起這類植物物種在之后的演替中隨著環(huán)境ABA含量的升高而失去競爭優(yōu)勢，后期演替物種則因能忍受高濃度ABA取代早期演替植物的物種，從而說明ABA在群落演替中扮演著重要的角色。ABA是小分子有機酸，同為小分子有機酸的酚酸類物質(zhì)，在生態(tài)系統(tǒng)群落演替中是否也有著一席之地呢，還需要后續(xù)的研究去探索。

就目前的研究成果來看，酚酸類物質(zhì)的降解機制研究尚淺。隨著分子生物學的發(fā)展，運用分子手段對酚酸類物質(zhì)的降解過程進行研究，全面深入的探究酚酸類物質(zhì)的降解過程，并進一步探究酚酸類物質(zhì)降解關(guān)鍵基因與關(guān)鍵酶的重要作用。如今，在全球生態(tài)環(huán)境下，二氧化碳含量的升高影響植物的光合作用、種子萌發(fā)和幼苗的生長，研究表明二氧化碳濃度的升高還會影響水稻根系的分泌物，雖然這方面的研究尚淺，但二氧化碳濃度的升高并伴隨著氣溫的上升是否會對酚酸類物質(zhì)的特性產(chǎn)生影響，具有化感特性的植物其優(yōu)良的性狀是否會發(fā)生改變，以及植物酚酸類物質(zhì)的變化又將怎樣反作用于生態(tài)系統(tǒng)，這些問題都有待于進一步的研究。季節(jié)性反常變化，環(huán)境的復雜變化使得對酚酸類物質(zhì)的研究也日趨變得復雜，因此，未來酚酸類物質(zhì)的研究應(yīng)考慮全球環(huán)境變化的因素。

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A review of allelopathic researches on phenolic acids

XIE Xingguang1, CHEN Yan1, BU Yuanqing2,DAI Chuanchao1,*

1JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics,JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforIndustrializationofMicrobialResources,CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210023,China2NanjingInstituteofEnvironmentalSciencesoftheMinistryofEnvironmentalProtectionofPRChina,Nanjing210042,China

Phenolic acids are secondary metabolites that are widely distributed in plant tissues and closely associated with plant growth. In recent decades, phenolic acids have been studied and knowledge of them has grown internationally, but the functions of phenolic acids in the fields of biology, ecology, and agriculture are still unclear. In natural and agro-ecosystems, phenolic acids could be released into the external environment in a variety of ways. As research on the roles of phenolic acids as allelochemicals has increased, it has been found that the effectiveness of their allelopathic activities mainly depends on its existing state and specific concentrationinvitro. At present, both the ecological and economic problems caused by phenolic acids are attracting more attention from scholars; problems such as the weakening of ecosystem regenerative capacity, restraint of plant growth, soil microflora imbalances, soil fertility decay, decrease in crop yield and increased rates of plant diseases and insect pests. Effective measures for resisting the potential environmental impacts resulting from phenolic acids in natural and agro-ecosystems are urgently needed. Microorganisms are regarded as important decomposers of pollutants in the natural environment so it is important to screen for suitable microorganisms that play an important role in the degradation of phenolic acids and in relieving the negative influences resulting from phenolic acids produced by plants. This can be done under pure culture or field conditions. In addition, it has been found that applying varieties of selected microorganisms can have a positive effect on crop growth environments. Therefore, it is necessary to further explore the degradation mechanisms of phenolic acids by microorganisms and understand the steps, and the regulatory role, of key enzymes and genes during this process. Meanwhile, scientists also need to clarify the mechanisms of degradation of different phenolic acids by specific microorganisms at the molecular level, and create environmentally friendly strains that have the function of efficient degradation of phenolic acids in ecosystems. It is also necessary to explore how the functional microorganisms relieve allelopathic autotoxicity caused by phenolic acids under complex ecological environments. This includes phenomena such as the concentration of effective allelochemicals directly reduced by highly efficient degradation and transformation of functional microorganisms, degradation of phenolic acids together with other environmental microorganisms, or comprehensive regulation of the activity and resistance of ecosystems to reducing the problems caused by phenolic acids in crops. We suggest that microorganisms play an important role in sustainable agricultural development and environmental protection. In addition, the diverse structures and functions of phenolic acids can be used to develop, and use, natural ecological reagents considered to be efficient and pollution free ecological pesticides. Hence, further comprehensive understanding of these biological molecules will contribute to maintenance and protection of whole ecosystems. In this review, the major sources and allelopathy of phenolic acids are introduced, and phenolic acid degradation mechanisms, metabolic pathways, and the corresponding studies of this at a molecular level are expounded. The current problems with the study of phenolic acid allelochemicals are also proposed. Finally, the trends and prospects in this field of research are also discussed.

phenolic acids; allelochemical; allelopathy; biodegradation; microorganisms; molecular level

國家自然科學基金(31370507); 環(huán)境保護部行業(yè)公益項目(201009023); 江蘇高教優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目; 南京市科委工程中心創(chuàng)新能力提升項目(201105058)

2013- 02- 21; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2014- 03- 17

10.5846/stxb201302210285

*通訊作者Corresponding author.E-mail: daichuanchao@njnu.edu.cn

謝星光,陳晏,卜元卿,戴傳超.酚酸類物質(zhì)的化感作用研究進展.生態(tài)學報,2014,34(22):6417- 6428.

Xie X G, Chen Y, Bu Y Q,Dai C C.A review of allelopathic researches on phenolic acids.Acta Ecologica Sinica,2014,34(22):6417- 6428.