解瑤，劉中成，張艷芬，趙麗健，劉利鵬

（1.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 實(shí)驗(yàn)室管理辦公室，河北 保定 071002）

1990年，Tuerk等首次利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），從人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出與噬菌體T4DNA 聚合酶有高親和力和特異性結(jié)合的寡核苷酸，即核酸適配子［1］.適配子功能與單克隆抗體類似，但在諸多方面優(yōu)于抗體：可化學(xué)合成、性質(zhì)穩(wěn)定、容易修飾、可以用半抗原小分子作為靶標(biāo)進(jìn)行篩選等，在化學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域受到諸多學(xué)者的關(guān)注［2］.近年來，基于適配子制作傳感器，檢測靶物質(zhì)，正成為適配子應(yīng)用的新熱點(diǎn)，其中膠體金標(biāo)記適配子可制作光學(xué)、化學(xué)傳感器，它具有和免疫膠體金相同的優(yōu)勢，可簡單、快速地檢測靶物質(zhì)，且無需專業(yè)人員和大型儀器［3－5］.

制備膠體金標(biāo)記抗體主要利用膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子正電荷基團(tuán)牢固結(jié)合，目前對(duì)于適于標(biāo)記抗體的膠體金制備工藝已有很多報(bào)道，但有關(guān)膠體金標(biāo)記適配子的研究相對(duì)較少［6－7］.宋宏新等［8］制備適于標(biāo)記抗體的膠體金時(shí)僅對(duì)檸檬酸三鈉和抗壞血酸2種還原劑進(jìn)行了優(yōu)化，未考慮其他因素的影響，以及各種參數(shù)之間的交叉影響.楊玉新等［9］人也只是并列比較4種還原劑制備單分散膠體金顆粒的方法.本實(shí)驗(yàn)在前人對(duì)適于標(biāo)記抗體膠體金制備研究基礎(chǔ)上，采用了固定變量法，優(yōu)化了制備適于標(biāo)記適配子膠體金的條件.因?yàn)檫m配子可通過正電荷與膠體金顆粒形成靜電吸引作用，所以膠體金顆粒均勻度、顆粒大小等因素將直接影響適配子的標(biāo)記以及傳感器的靈敏度.考慮到膠體金與蛋白及核酸結(jié)合的不同，探索適合標(biāo)記核酸適配子的膠體金制備工藝，將為適配子在物質(zhì)檢測分析中的應(yīng)用提供基礎(chǔ).

本文系統(tǒng)地比較了檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸等還原劑的種類及其加入量，并對(duì)pH 值、反應(yīng)時(shí)間、沸騰時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化.將所制備膠體金與適配子進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)紫外可見光譜掃描和透射電鏡鑒定，獲得了滿足標(biāo)記核酸適配子要求的膠體金.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

氯金酸（HAuCl4）購自Aladdin公司；鏈霉素購自中國藥品生物制品檢定所；檸檬酸三鈉購自天津市北辰驊躍化學(xué)試劑廠；抗壞血酸購自上海至新化工有限公司；鞣酸購自天津市達(dá)潤能化工有限公司；實(shí)驗(yàn)所用的單鏈和雙鏈核酸及鏈霉素適配子均由上海生工公司合成.其余均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 膠體金制備

用王水浸泡所用玻璃容器，蒸餾水清洗5次直至干凈，烘干備用.用超純滅菌水配制0.1g／L 氯金酸溶液.首先對(duì)不同還原劑進(jìn)行條件優(yōu)化：分別取20mL氯金酸溶液，調(diào)節(jié)pH 值為3.0，加入到3個(gè)50mL的圓底燒瓶中，做好標(biāo)記，攪拌煮沸，分別立即加入500μL 10g／L 的檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸3種不同的還原劑，顏色變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)加熱攪拌6min，撤去熱源，攪拌至室溫.將所得膠體金溶液轉(zhuǎn)入棕色瓶中，4 ℃保存.同時(shí)采用單一變量法對(duì)還原劑加入量、反應(yīng)溶液pH 值、加入檸檬酸三鈉前的沸騰時(shí)間以及加入還原劑變色后繼續(xù)煮沸時(shí)間等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用紫外可見光譜掃描法對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行檢測.

1.3 膠體金性能測定

將不同長度單鏈和雙鏈DNA（20，80，3 482bp）用滅菌水配制成100nmol／L 溶液.不同長度的單鏈DNA（ssDNA）煮沸5min，冰浴10min，加入到50μL膠體金中室溫震蕩孵育1h，雙鏈DNA（dsDNA）則直接加入到50μL膠體金中室溫震蕩孵育1h，加入50μL 200mmol／L NaCl，充分反應(yīng)10min，檢測反應(yīng)結(jié)果.標(biāo)記ssDNA（80bp）的膠體金以及未標(biāo)記ssDNA 的膠體金（純膠體金），加入NaCl后的結(jié)果用透射電鏡進(jìn)行鑒定.

1.4 標(biāo)記適配子的膠體金性能測定

50μL膠體金中加入100nmol／L鏈霉素特異性適配子室溫孵育1h，制得了標(biāo)記適配子的膠體金［8］.在所制得的標(biāo)記適配子膠體金中，分別加入0，0.8，1.6μmol／L 鏈霉素，室溫孵育2h，加入200 mmol／L NaCl.觀察顏色變化，用紫外可見光譜掃描和透射電鏡對(duì)其結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳還原劑的確定

采用檸檬酸三鈉制備膠體金，得到的膠體金呈酒紅色，外觀效果良好，透明，無懸浮物出現(xiàn)；采用抗壞血酸制備膠體金，得到的膠體金溶液呈紫紅色，透明，無漂浮物，符合外觀要求；采用鞣酸制備的膠體金，顏色為亮紅色，透明，無懸浮物.對(duì)400～800nm 處吸光值進(jìn)行掃描，得到掃描圖譜，如圖1所示，檸檬酸三鈉作為還原劑時(shí)峰寬相對(duì)于其他較窄，說明膠體金顆粒大小均一，分散良好［1］.所以選擇檸檬酸三鈉作為還原劑.

2.2 檸檬酸三鈉添加量的確定

10g／L檸檬酸鈉添加量分別為200，300，400，500，600μL 時(shí)，制備得到的膠體金均透明且無懸浮物出現(xiàn).其中，檸檬酸三鈉添加量為200μL 時(shí)溶液呈紫色，300，400μL 時(shí)呈紫紅色，500，600μL 呈酒紅色.經(jīng)400～800nm 紫外可見分光光度計(jì)掃描，如圖2所示，檸檬酸三鈉添加量為200μL 時(shí)峰位置在535nm 處，300，400μL時(shí)峰位置在525nm 處，500，600μL時(shí)峰位置在520nm 處，由此可知隨著還原劑添加量增加，峰位置逐漸變小，顆粒也逐漸變小.所以選擇500μL為檸檬酸三鈉的最佳添加量.

圖1 不同還原劑制得膠體金的掃描圖譜Fig.1 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different reductants

圖2 不同檸檬酸三鈉添加量制備膠體金掃描圖譜Fig.2 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different amounts of sodium citrate

2.3 膠體金溶液pH 值的確定

在溶液pH 值分別為3.0，4.0，6.0，8.0，10.0的情況下制備膠體金.在pH 為3.0，4.0時(shí)，溶液呈酒紅色，且峰型和峰寬相同，峰位置都在520nm 左右；在pH 為6.0，8.0時(shí)，溶液呈紫紅色，峰型和峰寬接近，峰位置都在539nm 左右；pH 為10.0時(shí)，顏色為淺紫色，峰位置在530nm 左右.從圖3可以看出，降低pH 值，吸收峰的最大值向波長短的方向移動(dòng)，所以，選擇3.0作為最優(yōu)pH.

圖3 不同pH 值條件下所得的膠體金的掃描圖譜Fig.3 Spectrum scanning of AuNPs synthesized in different pH

2.4 氯金酸沸騰時(shí)間的確定

如圖4所示，0，2，4min時(shí)的最大吸收峰接近，基本處于523nm 處，此時(shí)制備得到的膠體金溶液呈酒紅色，透明度較高，色澤穩(wěn)定.而沸騰時(shí)間往后推移，經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描得到的最大吸收峰有所偏移，且得到的溶液顏色加深，一般呈現(xiàn)紫色，若時(shí)間再延長，甚至?xí)霈F(xiàn)黑色物質(zhì)，所得到的膠體金溶液較之前穩(wěn)定性較差.

2.5 不同反應(yīng)時(shí)間的確定

改變氯金酸在沸騰后加入檸檬酸三鈉時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，所得到膠體金的顏色變化如圖5所示，在0，2，4，6，8min時(shí)，顏色依次呈現(xiàn)為淺粉色、粉色、紅色、酒紅色、紫紅色.紫外掃描圖譜中反應(yīng)6min，吸光度最高.說明在0.1g／L氯金酸反應(yīng)體系為20mL和500μL檸檬酸三鈉溶液條件下反應(yīng)6min時(shí)溶液的顏色為酒紅色，符合膠體金制備要求.

圖4 氯金酸不同的初始沸騰時(shí)間所得膠體金的掃描圖譜Fig.4 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different times of boiling

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間制得膠體金的光譜Fig.5 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different reaction time

2.6 不同長度DNA 與膠體金反應(yīng)

膠體金能夠分散良好的原因是膠體金表面檸檬酸離子的斥力作用，而適配子標(biāo)記膠體金能夠分散良好的原因是適配子的負(fù)電子斥力和空間位阻的共同作用，比離子斥力作用要穩(wěn)定很多［12］.所以標(biāo)記適配子的膠體金加入鹽后，不會(huì)發(fā)生聚沉.由圖6可知，長度分別為20，80，3 482bp的ssDNA 與膠體金孵育后，加入NaCl后顏色不變，而長度為20，80，3 482bp的雙鏈DNA 與膠體金孵育，加入NaCl后，顏色由紅變紫.其中陰性對(duì)照為不加適配子的膠體金，加入NaCl后，顏色變紫（圖6）.電鏡結(jié)果如圖7所示，標(biāo)記ssDNA 的膠體金，加入NaCl后顏色不變，分散保持均勻，未標(biāo)記適配子的膠體金，加入NaCl后，發(fā)生聚沉.由此可知，本研究制備的膠體金可與長度大小不同的單鏈核酸結(jié)合，不產(chǎn)生靜電作用，從而保護(hù)膠體金不發(fā)生聚沉，而雙鏈DNA 則不能保護(hù)膠體金，表明本實(shí)驗(yàn)制備的膠體金可穩(wěn)定地標(biāo)記單鏈核酸［13－14］.

圖6 不同長度DNA與膠體金反應(yīng)結(jié)果Fig.6 Results of different lengths of DNA－lable AuNPs

膠體金粒徑越小，比表面積就越大，電鏡檢測結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)所制備的膠體金粒徑為15～20nm，而Cvak等［15］研究結(jié)果表明：標(biāo)記抗體最適合膠體金粒徑范圍是15～40nm，二者較為接近，可能由于抗體和適配子與膠體金結(jié)合的原理相同，均是利用膠體金正電荷與抗體或適配子的負(fù)電荷靜電引力相互作用.

圖7 膠體金占ssDNA反應(yīng)電鏡檢測結(jié)果Fig.7 Results of the reaction between aptamers and AuNPs by TEM

2.7 標(biāo)記適配子的膠體金性能的測定

已知標(biāo)記適配子的膠體金加入鹽后，不會(huì)發(fā)生聚沉.加入半抗原小分子鏈霉素后，適配子脫離了膠體金，和鏈霉素發(fā)生特異性結(jié)合，加入鹽后，膠體金發(fā)生聚沉，顏色發(fā)生變化.且隨著鏈霉素濃度的增加，聚沉程度加大，結(jié)果顯示顏色由紅變紫再變藍(lán)（圖略），且紫外分光光度計(jì)掃描圖譜顯示，620nm 處峰高逐漸增大，說明聚沉徹底（圖8）.掃描電鏡結(jié)果與此相同（圖9）.

圖8 不同濃度鏈霉素加入標(biāo)記適配子的膠體金的光譜Fig.8 Spectrum scanning of different concentaions of streptomycin add to aptamer－labled AuNPs

圖9 不同濃度鏈霉素加入到標(biāo)記適配子的膠體金的TEMFig.9 Results of different concentations of streptonycin add to aptamer－labled AuNPs by TEM

3 結(jié)論

膠體金在食品檢測、醫(yī)學(xué)初診、環(huán)境監(jiān)測等諸多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，制備方法也有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，但標(biāo)記核酸適配子膠體金的成熟制備工藝未見報(bào)道［16－17］.本實(shí)驗(yàn)對(duì)還原劑類型及加入量、pH 條件、初始沸騰時(shí)間及反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適于標(biāo)記適配子膠體金的制備工藝，并對(duì)所制備的膠體金進(jìn)行了性能鑒定，為制備基于適配子的膠體金比色傳感器奠定了基礎(chǔ).

［1］ TUERK C，GOLD L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA Ligands to bacteriophage T4DNA polymerase［J］.Science，1990，249：505－510.

［2］ JOHN G，BRUNO.A review of therapeutic aptamer conjugates with emphasis on new approaches［J］.Pharmaceuticals，2013，6（3）：340－357.

［3］ BARTHELMEB L，JONCA J，HAYAT A，et al.Enzyme－linked aptamer assays（ELAAs），based on a competition format for a rapid and sensitive detection of ochratoxin a in wine［J］.Food Control，2011，22：737－743.

［4］ ZHU Ye，CHANDRA P，BAN C，et al.Electrochemical evaluation of binding affinity for aptamer selection using the microarray chip［J］.Electroanalysis，2012，24（5）：1057－1064.

［5］ SONG K M，LEE S，BAN C，et al.Aptamers and their biological applications［J］.Sensors，2012，12：612－631.

［6］ 宋宏新，鄒聯(lián)柱，李韻，等.納米膠體金的制備及其抗體標(biāo)記研究［J］.食品科學(xué)，2011，36（3）：249－252.SONG Hongxin，ZOU Lianzhu，LI Yun，et al.Preparation of nanosized colloidal gold and its conjugation with antibody［J］.Food Science and Technology，2011，36（3）：249－252.

［7］ 韓剛毅.膠體金標(biāo)記抗體技術(shù)［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1989，16（1）：31－35.HAN Gangyi.The technology of antibody labled with colloidal gold［J］.Progress in Biochemistry and Biophysics，1989，16（1）：31－35.

［8］ 宋宏新，符海英，薛海燕，等.兩種膠體金制備方法的比較研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（1）：53－55.SONG Hongxin，F(xiàn)U Haiying，XUE Haiyan，et al.Comparative study on two kinds of colloidal gold preparation［J］.Journal of Henan University of Technology，2012，33（1）：53－55.

［9］ 楊玉新，葉陽，周有祥，等.四種化學(xué)還原法制備膠體金的比較研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（3）：476－482.YANG Yuxin，YE Yang，ZHOU Youxiang，et al.Comparative study on four chemical reduction methods for preparing colloidal gold［J］.Hubei Agricultural Sciences，2011，50（3）：476－482.

［10］ ZHOU Nandi，WANG Jingyuan，ZHANG Juan，et al.Selection and identification of streptomycin－specific single－stranded DNA aptamers and the application in the detection of streptomycin in honey［J］.Talanta，2013，108：109－116.

［11］ 彭劍淳，劉曉達(dá)，丁曉萍，等.可見光光譜法評(píng)價(jià)膠體金粒徑及分布［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2000，24（3）：211－212.PENG Jianchun，LIU Xiaoda，DING Xiaoping，et al.Evaluation of the particle diameter of colloidal gold and its distribution through visible spectroscopy［J］.Bull Acad Ml Med Sci，2000，24（3）：211－212.

［12］ NIKHIL R，JANA，YING Y J.Synthesis of functionalized Au nanoparticles for protein detection［J］.Adv Mater，2008，20：430－434.

［13］ LI Huixiang，ROTHBER L J.Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：14036－14039.

［14］ LI Huixiang，ROTHBERG L J.Label－free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA amplified by the polymerase chain reaction［J］.J Am Chem Soc，2004，126：10958－10961.

［15］ CVAK B，PUM D，MOLINELLI A，et al.Synthesis and characterization of colloidal gold particles as labels for antibodies as used in lateral flow devices［J］.Analyst，2012，137：1882－1887.

［16］ SONG K M，JEONG E，JEON W，et al.Aptasensor for ampicillin using gold nanoparticle based dual fluorescence－colorimetric methods［J］.Ban Anal Bioanal Chem，2012，402：2153－2161.

［17］ 汪琳，周琦，賴平安，等.免疫膠體金技術(shù)及其在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14（4）：56－58.WANG Lin，ZHOU Qi，LAI Pingan，et al.The technology of colloid gold－immunochromatography and the application in Inspection and Quarantine［J］.Inspection and Quarantine Science，2004，14（4）：56－58.