孫婧陶+劉佳麗+張寶修+茹李波+李鐘淑+方南洙

摘要：研究了亞硒酸鈉對(duì)過氧化氫導(dǎo)致的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。將延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞分為3組：正常組（對(duì)照組1）、過氧化氫損傷組（對(duì)照組2）、亞硒酸鈉保護(hù)組。MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力，Hoechst33342/PI 雙染、Giemsa染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，DHE染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。結(jié)果表明，與對(duì)照組2相比，濃度為0.25、0.5、1.0 μg/mL的亞硒酸鈉保護(hù)組的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞活力上升，細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，活性氧含量減少。其中以0.5 μg/mL亞硒酸鈉處理組效果最顯著。說明0.5 μg/mL的亞硒酸鈉可以減少過氧化氫所致的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的氧化損傷，提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量。表明亞硒酸鈉對(duì)延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞過氧化氫所致氧化損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：亞硒酸鈉；乳腺上皮細(xì)胞；氧化損傷；凋亡

中圖分類號(hào)： S827.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0155-04

收稿日期：2013-07-23

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：20100228）。

作者簡(jiǎn)介：孫婧陶（1990—），女，河北承德人，碩士，主要從事動(dòng)物繁殖與生物技術(shù)研究。E-mail：sunjt1990@126.com。

通信作者：方南洙（1960—），男，朝鮮族，博士，教授，主要從事動(dòng)物繁殖與生物技術(shù)研究。E-mail：nzfang@ybu.edu.cn。有氧代謝會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括羥基自由基（·OH）、超氧化物陰離子（ O-2· ）、單線態(tài)氧（1O2）及過氧化氫（H2O2），這些物質(zhì)會(huì)在生物體內(nèi)不斷生成[1]。細(xì)胞自身的抗氧化功能會(huì)使細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，但是當(dāng)這種平衡一旦被打亂，細(xì)胞即處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下。氧化應(yīng)激存在時(shí)，這種氧化損傷會(huì)導(dǎo)致一些至關(guān)重要的生物分子（包括誘導(dǎo)氧化損傷的基因組）聚集，最終導(dǎo)致一些生物效應(yīng)，比如信號(hào)傳導(dǎo)的改變、與有絲分裂相關(guān)表達(dá)基因的改變、突變及細(xì)胞死亡[2-3]等。凋亡（細(xì)胞程序性死亡），是細(xì)胞參與的自我破壞的一種細(xì)胞死亡形式，該過程伴隨著細(xì)胞一系列典型的形態(tài)變化及生物化學(xué)變化[4]，包括細(xì)胞縮小、染色質(zhì)固縮、DNA核小體間的裂解[5]。細(xì)胞凋亡與壞死盡管都能造成細(xì)胞死亡，但是二者是不同的。為了防止壞死，受到破壞細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，緊接著會(huì)向細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)釋放酶，造成炎癥反應(yīng)。已經(jīng)有研究證明ROS和氧化損傷與細(xì)胞凋亡是有關(guān)聯(lián)的[6-8]。低劑量的H2O2通過產(chǎn)生羥基自由基（·OH）和改變氧化/抗氧化途徑來誘導(dǎo)凋亡[9]。

硒對(duì)于維持各種各樣生理活動(dòng)是必要的一種元素[10]，同時(shí)硒是GSH-Px的成分，具有抗氧化的作用，它是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑，以Sec（含硒半胱氨酸）的形式發(fā)揮作用，硒參與構(gòu)成了它的生物活性中心。GSH-Px用來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間過氧化氫濃度[11]。硒元素與維生素E一樣被認(rèn)為在清除自由基方面能夠發(fā)揮重要作用[12-13]。在細(xì)胞培養(yǎng)中，硒元素以亞硒酸鈉的形式存在，通過減少自由基及抑制脂質(zhì)過氧化物來保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害[14-17]。Gopalakrishina 等研究稱，向骨髓間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加硒元素，可以很好地使細(xì)胞抗氧化功能恢復(fù)從而降低對(duì)細(xì)胞的傷害[18]。因此，向培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉可以對(duì)受到氧化損傷的細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。

1材料與方法

1.1材料

主要試劑：胎牛血清（fetaL bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自GIBCO；姬姆薩（Giemsa）染液購(gòu)自貝索生物科技有限公司；其他藥品，均購(gòu)自SIGMA公司。

1.2方法

1.2.1延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞（DGMECs）的培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)加入100 mg/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、5 μg/mL胰島素。培養(yǎng)條件為38 ℃、5% CO2、飽和濕度。乳腺上皮細(xì)胞傳代采用胰蛋白酶消化法，細(xì)胞達(dá)到80%融合狀態(tài)時(shí)，用溫水浴后的PBS洗滌2次，加入0.15 %Trypsin-0.02 %EDTA，置于培養(yǎng)箱中，消化4～5 min，在倒置顯微鏡下觀察消化情況，待細(xì)胞收縮變圓時(shí)，用含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，吹打使細(xì)胞脫離瓶壁形成單細(xì)胞懸液，離心，接種（圖1）。

1.2.2H2O2誘導(dǎo)氧化損傷模型的建立參照先前研究[19]，選取可以導(dǎo)致40%～50%細(xì)胞凋亡的100 μmol/L的H2O2作用4 h建立氧化損傷模型。

1.2.3亞硒酸鈉（Sodium seLenite，SS）的配制用超純水將亞硒酸鈉溶解，配置成1 mg/mL的亞硒酸鈉儲(chǔ)存液，分裝，-20 ℃ 保存。用無FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋成各所需濃度，亞硒酸鈉的工作濃度為0.25、0.5、1.0 μg/mL，即用即配。

1.2.4試驗(yàn)分組待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合狀態(tài)時(shí)，分為以下5個(gè)試驗(yàn)組：（1）對(duì)照組1：換為無FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)28 h；（2）對(duì)照組2：先用無FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換為含100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng) 4 h；（3）亞硒酸鈉處理組：用含不同濃度（0.25、0.5、1.0 μg/mL）亞硒酸鈉DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再用含100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。

1.2.5細(xì)胞活力檢測(cè)將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107個(gè)/L接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后吸棄原培養(yǎng)液，加入含不同濃度（0.25、0.5、1.0 μg/mL）的SS的DMEM/F12培養(yǎng)液，處理細(xì)胞24 h，吸棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌。除對(duì)照組1外，其余各組均加入100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液，刺激細(xì)胞4 h，然后每孔加入20 μL 四甲基偶氮唑鹽（MTT，5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸取上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩器上振蕩10 min，使紫色結(jié)晶甲瓚充分溶解，于490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（D）。各濃度組細(xì)胞存活率=各濃度組D490 nm值/不添加亞硒酸鈉組D490 nm×100%。endprint

1.2.6Hoechst33342/PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡采用 Hoechst33342/PI 雙染色檢測(cè)DGMECs細(xì)胞凋亡。6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種1×107個(gè)細(xì)胞，用“1.2.4”試驗(yàn)分組方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，棄去上清，小心用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌1次，每孔加入10 μg/mL的 Hoechst33342 染液1 mL，置于培養(yǎng)箱中37 ℃避光反應(yīng) 20 min，棄上清，PBS洗滌3次，每孔再加入20 μg/mL的PI染液 1 mL，37 ℃避光反應(yīng)15 min，PBS洗滌3次。染色完成后，置于熒光顯微鏡下，在波長(zhǎng)為365 nm的紫外燈下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Giemsa染色蓋玻片經(jīng)泡酸、高壓滅菌后，在超凈臺(tái)內(nèi)自然晾干，小心放入6孔板內(nèi)，制作細(xì)胞爬片。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DGMECs，離心，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，取100～200 μL細(xì)胞懸液接種于蓋玻片上，隔夜，向6孔板內(nèi)加入足量的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。對(duì)照組1：換為無FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)28 h；對(duì)照組2：先用無FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換為含100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h；亞硒酸鈉處理組：用濃度為0.5 μg/mL的亞硒酸鈉DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再用含100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。結(jié)束培養(yǎng)后，用PBS洗滌3次，1.5%甲醛室溫下固定20 min，吸棄固定液，PBS洗滌3次，加入冰甲醛，室溫下透化20 min。小心取出蓋玻片，先用瑞氏-姬姆薩A液染色3～5 min，再將瑞氏-姬姆薩B液滴加于A液上面（滴加之量為A液的 2～3倍），以嘴或洗耳球吹出微風(fēng)使液面產(chǎn)生漣漪狀，使兩液充分混合，染色15～20 min，以流水將染色液沖洗干凈。置于顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.8活性氧（ROS）的測(cè)定DGMECs接種于6孔培養(yǎng)板（1×107個(gè)/孔），待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～80%融合狀態(tài)時(shí)，用“124”試驗(yàn)分組方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，棄去上清，小心用PBS洗滌1次，加入20 μmol/L的DHE（Dihydroethidium） 1 mL，37 ℃ 孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞5次，以充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞的DHE。直接用熒光顯微鏡觀察紅色熒光強(qiáng)度。

1.2.9數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析多重比較檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異性，顯著標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示。

2結(jié)果

2.1亞硒酸鈉對(duì)氧化應(yīng)激模型下DGMECs活力的影響

如圖2所示，DGMECs由H2O2處理后（對(duì)照組2），細(xì)胞活力為49.35%，加入各濃度亞硒酸鈉后，細(xì)胞活力有所上升，0.5 μg/mL處理組（76.28%）、1.0 μg/mL處理組（6595%），與對(duì)照組2（49.35%）相比，差異顯著（P<005），025 μg/mL處理組（54.45%）與對(duì)照組2（49.35%）無顯著性差異（P>0.05）。

2.2亞硒酸鈉對(duì)DGMECs氧化損傷凋亡的影響

由圖3可知，對(duì)照組2處理的細(xì)胞，細(xì)胞不僅出現(xiàn)了大面積固縮現(xiàn)象，且已經(jīng)有少量的細(xì)胞出現(xiàn)了壞死現(xiàn)象。亞硒酸鈉保護(hù)組，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及壞死的比例相對(duì)于對(duì)照組2有所下降，但是0.25 μg/mL保護(hù)組，仍然有部分壞死細(xì)胞，說明該濃度對(duì)DGMECs的保護(hù)作用不明顯。1.0 μg/mL 保護(hù)組，經(jīng)觀察，無壞死細(xì)胞出現(xiàn)，但是具有凋亡現(xiàn)象的細(xì)胞仍然大量存在。0.5 μg/mL保護(hù)組，細(xì)胞凋亡比例明顯減少，正常形態(tài)細(xì)胞多于除對(duì)照組1外的各組。故選擇0.5 μg/mL亞硒酸鈉進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3Giemsa染色法觀察亞硒酸鈉對(duì)DGMECs的保護(hù)作用

由圖4可知，對(duì)照組2與對(duì)照組1相比，細(xì)胞核出現(xiàn)大面積固縮現(xiàn)象，發(fā)生凋亡的細(xì)胞及凋亡小體被染成深紫色；而 0.5 μg/mL 濃度的亞硒酸鈉保護(hù)組，細(xì)胞核固縮的比例下降，凋亡細(xì)胞數(shù)量減少。

2.4亞硒酸鈉對(duì)氧化損傷DGMECs的 ROS水平影響

DHE熒光染色結(jié)果顯示（圖5），對(duì)照組1僅見微弱的紅色熒光，而對(duì)照組2紅色熒光強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，0.5 μg/mL亞硒酸鈉保護(hù)組紅色熒光強(qiáng)度較對(duì)照組2明顯下降。故DGMECs在0.5 μg/mL亞硒酸鈉的保護(hù)作用下，可以有效減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

3討論

在過去的十多年中，家畜普遍硒元素缺乏[20]，后來人們開始在飼料中添加充足的硒元素[21]，因?yàn)樗梢燥@著提高家畜的繁殖性能[22-26]，但是，硒元素可以防止家畜繁殖障礙的生物化學(xué)機(jī)理到現(xiàn)在為止還不是很清楚。

硒作為一種微量元素，小劑量存在時(shí)，其對(duì)生物體是有益的，但是使用劑量過高，會(huì)有很強(qiáng)的毒性作用，甚至有致癌的可能性。硒元素臨界的作用劑量目前還沒有定論[27-29]。本試驗(yàn)中，向培養(yǎng)液中添加了0.5 μg/mL亞硒酸鈉，有效地保護(hù)了DGMECs所受到的氧化應(yīng)激，但是隨著濃度的增加，1.0 μg/mL 亞硒酸鈉開始表現(xiàn)出了對(duì)細(xì)胞的毒性作用，說明 0.5 μg/mL 亞硒酸鈉能夠提高DGMECs抵制氧化應(yīng)激的能力，從而減少細(xì)胞的氧化損傷程度，提高其細(xì)胞活力。通過Hoechst/PI及Giemsa染色結(jié)果可知，亞硒酸鈉的加入，降低了細(xì)胞的凋亡率，推斷亞硒酸鈉對(duì)DGMECs發(fā)揮了相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。

體外培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度要比體內(nèi)環(huán)境中高一些，并且細(xì)胞在進(jìn)行有氧代謝的過程中會(huì)產(chǎn)生自由基。硒許多的生物作用都?xì)w因于其強(qiáng)大的抗氧化功能，包括直接消除ROS，消除金屬離子間的螯合作用，以及重組成Se-GPx抗氧化物。亞硒酸鈉通過降低活性氧以及抑制脂質(zhì)過氧化來防止細(xì)胞受到傷害[30]。Yeo等在體外培養(yǎng)腦源性神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs）的研究中發(fā)現(xiàn)硒可以防止細(xì)胞死亡，并且亞硒酸鈉可以抑制NPCs的H2O2誘導(dǎo)凋亡[31]。本研究中，采用DHE染色法檢測(cè)DGMECs內(nèi)ROS含量，結(jié)果顯示0.5 μg/mL亞硒酸鈉可以有效地降低細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，以減少ROS對(duì)細(xì)胞帶來的損傷。所以，亞硒酸鈉作為抗氧化劑來發(fā)揮其抗氧化作用，能夠有效地抑制細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的氧化應(yīng)激環(huán)境，從而減少DGMECs所受到的氧化損傷。endprint

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