李 宇，宋錦寧，張 明，安吉洋，孫 鵬，李丹東，馬旭東，趙雅慧

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

◇專題研究◇

彌漫性軸索損傷后內質網(wǎng)鈣釋放對軸突內早期鈣離子濃度的影響

李 宇，宋錦寧，張 明，安吉洋，孫 鵬，李丹東，馬旭東，趙雅慧

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

目的 研究彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)后內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)鈣釋放的變化，以及對軸突內早期鈣離子濃度的影響，并探討造成ER鈣釋放的可能分子機制。方法 使用體外培養(yǎng)7～12 d的小鼠神經(jīng)元行軸突牽拉損傷建立體外DAI模型，根據(jù)是否行牽拉損傷分為損傷組及對照組。使用ER Tracker Red標記ER，觀察ER在軸突損傷前后的分布。通過Fluo-4 AM鈣探針及激光共聚焦鈣成像技術測量單個軸突內鈣離子濃度的變化，并使用20 mmol/L咖啡因作用于細胞，使ER內鈣離子快速排空，測量軸突部位咖啡因作用前后的鈣離子濃度變化，從而間接觀察ER內鈣存量的變化。結果 ER Tracker Red熒光結果顯示ER存在于神經(jīng)元軸突部位中，損傷后的軸突腫脹部位存在ER聚集的現(xiàn)象。神經(jīng)元牽拉損傷后，被牽拉的軸突鈣離子濃度明顯升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，受損的軸突表現(xiàn)出腫脹及“串珠樣”變性等病理學改變。除損傷后2 min外，使用無鈣細胞外液雖然明顯降低了牽拉損傷導致的軸突的鈣離子濃度升高，但在2～30 min時間段中鈣離子濃度升高依然存在，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組中未經(jīng)牽拉損傷的神經(jīng)元軸突可被20 mmol/L咖啡因激起一個明顯的軸突鈣離子濃度升高，而牽拉損傷后的軸突對咖啡因的這種鈣升高反應程度明顯下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 DAI后的軸突鈣離子濃度升高不僅由細胞外鈣內流引起，細胞內鈣釋放同樣參與其中。ER是引起這種DAI后軸突內鈣釋放的細胞器來源。

腦外傷；彌漫性軸索損傷；鈣；內質網(wǎng)

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)是腦外傷(traumatic brain injury, TBI)的一種重要的病理形式，也被認為是一種特殊的TBI損傷類型[1-2]。DAI不同于其他類型的TBI，是因為其生物力學機制并非直接的機械性暴力作用于頭顱，而是機械暴力作用于頭顱后導致的頭顱加速性運動所致的剪應力損傷，最終剪應力作用于軸突(尤其是長軸突)，從而導致廣泛的軸突變性、斷裂[3]。

目前的研究認為，DAI后的軸突變性及斷裂過程主要發(fā)生在繼發(fā)性損傷階段(secondary injury, SI)，并發(fā)現(xiàn)軸突內鈣離子濃度([Ca2+]i)的升高是導致軸突繼發(fā)性變性及斷裂的基礎[4-5]。對于DAI后的軸突內[Ca2+]i升高主要認為是通過電壓依賴的鈣通道[6]、谷氨酸受體[7-9]及膜通透性改變[10]介導的，對于內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)這一重要的參與調節(jié)細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的細胞器在DAI介導的鈣升高過程中是否發(fā)揮著作用仍未被闡明。近年來的研究證實，DAI后細胞內鈣釋放參與了軸突早期的[Ca2+]i升高，但是并未揭示導致這種鈣釋放的亞細胞器來源[11]。同時，亦有研究表明在其他類型的軸突損傷、變性疾病中來自ER的鈣離子釋放參與介導了軸突的變性過程[12]。因此，本實驗采用細胞牽拉裝置對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元軸突進行牽拉致傷建立體外DAI模型，通過鈣成像技術檢測軸突內[Ca2+]i的變化情況，同時利用改變細胞外液鈣離子(無鈣細胞外液及含鈣細胞外液)以闡明牽拉損傷后引起軸突[Ca2+]i變化的鈣來源，進一步通過咖啡因促進ER鈣排空的方法判斷牽拉損傷后ER內鈣離子存量，從而揭示軸突牽拉損傷與ER鈣釋放的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 免疫細胞化學所用一抗：小鼠抗MAP2抗體(No.M4403，美國Sigma)；兔抗β-tubulin抗體(No.T3526，美國Sigma)。熒光二抗：山羊抗小鼠Alexa Flour 488 IgG(No.A-10680，美國Molecular Probe)；山羊抗兔Alexa Flour 594 IgG(No.A-11037，美國Molecular Probes)。免疫細胞化學所用的其他主要試劑：山羊血清(No.G9023，美國Sigma)；Triton X-100(No.T8532，美國Sigma)；胎牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA，No.A9418，美國Sigma)；抗熒光猝滅劑(含DAPI，No.P10144，美國Molecular Probes)。ER Tracker Red(No.E34250，美國Molecular Probes)；Fluo-4 AM(F-23917，美國Molecular Probes)；本實驗使用的儀器均由悉尼大學醫(yī)學院Bosche Institute提供，共聚焦顯微鏡(型號：LSM 510 META, 德國ZEISS)，倒置相差顯微鏡(型號：CKX31/CKX41，日本Olympus)，普通光學顯微鏡(No.DM2700 M 德國Leica)?？蔂坷枘z培養(yǎng)皿(STREX，日本B-Bridge，圖1)，牽拉裝置(No.ST-140-04，日本B-Bridge，圖2)。

圖1 不同規(guī)格的可牽拉硅膠培養(yǎng)皿實物圖

Fig.1 Stretchable silicon chambers of various sizes

1.2 神經(jīng)元原代培養(yǎng) 健康孕17～19 d小鼠，由悉尼大學醫(yī)學院Medical Foundation下屬的動物飼養(yǎng)中心提供，動物使用通過澳大利亞動物倫理委員會授權(項目名稱：The role of Store-operated Ca2+entry in Traumatic brain injury；項目編號：5916)。將小鼠置于700 mL/L乙醇中15 s后，無菌條件下剖腹取出胎鼠。斷頭取腦，放入預冷的含糖的D-Hanks平衡鹽液中。在解剖鏡下仔細分離去除腦膜及血管，分離出大腦皮質并剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小。組織塊以1.25 g/L的胰蛋白酶消化(37 ℃，15 min，Sigma)并輕吹打，制成密度為5×105/mL的單細胞懸液，接種于涂有多聚-L-賴氨酸(Sigma)包被的特制的硅膠培養(yǎng)皿中。在神經(jīng)元接種前于硅膠培養(yǎng)皿中央放置一條硅膠帶(2 mm×20 mm)，接種后24 h，待細胞貼壁后移除，從而使得中央?yún)^(qū)域為軸突聚集區(qū)。加完全培養(yǎng)基后放入37 ℃的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。于培養(yǎng)2 d時加入5 μmol/L的阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)細胞的過度增殖。作用24 h后，更換完全培養(yǎng)基，以后每2～3 d換液1次，每次更換一半培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基由Neurobasal(Gibco)+B27(Gibco)+谷氨酰胺(Gibco)以及青霉素、鏈霉素(Sigma)各100 U/mL組成。細胞培養(yǎng)7～12 d后待用。

1.3 神經(jīng)元純度及細胞活率的計算 采用免疫細胞化學染色的方法，使用微管相關蛋白2(microtubulin associate protein 2, MAP2)標記神經(jīng)元的細胞骨架結構，β-微管蛋白(β-tubulin)標記全部細胞的細胞骨架結構，以及DAPI標記全部細胞的細胞核。預熱的40 g/L多聚甲醛室溫固定細胞10 min，用含1 mL/L Triton X-100的PBS溶液室溫下通透細胞10 min。含100 mL/L山羊血清的PBS溶液在室溫下抗原封閉1 h后，加入含10 mL/L BSA配制的一抗，其中MAP2 1∶2 000稀釋，β-tubulin 1∶1 000稀釋，4 ℃過夜。PBS洗滌后加入含10 g/L BSA的二抗室溫孵育1 h，洗滌后避光晾干。加入含DAPI的防熒光淬滅劑后封片，干燥后置于4 ℃冰箱待用。共聚焦顯微鏡在10×放大倍數(shù)下隨機采集圖像，每個樣本隨機選取5個視野，使用Image J(NIH，美國)軟件對細胞計數(shù)分析。神經(jīng)元純度(%)=MAP2陽性細胞數(shù)/(MAP2陽性細胞數(shù)+β-tubulin陽性細胞數(shù))

用錐蟲藍(臺盼藍)對細胞進行活性分析。40 g/L臺盼藍室溫孵育細胞2 min，然后在普通光學顯微鏡下觀察計數(shù)。活率計算仍采用10×放大倍數(shù)下隨機選擇的5個視野進行。細胞活率(%)=臺盼藍陰性細胞數(shù)/(臺盼藍陰性+臺盼藍陽性細胞數(shù))

1.4 DAI細胞牽拉模型建立及分組 用細胞牽拉裝置建立DAI細胞模型[13-15]。將含有經(jīng)培養(yǎng)7～12 d神經(jīng)元的硅膠培養(yǎng)皿固定于牽拉裝置上(圖2)，設置牽拉長度為初始長度的120%，牽拉時間為500 ms，牽拉次數(shù)為1次，牽拉方向為1維單軸牽拉。損傷組神經(jīng)元軸突行上述的一維牽拉損傷，對照組神經(jīng)元不行牽拉損傷。其中損傷組中根據(jù)灌流人工腦脊液(artificial cerebral spinal fluid, ACSF)含鈣與否又分為損傷+含鈣ACSF及損傷+無鈣ACSF兩個亞組。

圖2 可牽拉硅膠培養(yǎng)皿置于牽拉裝置實物圖

Fig.2 A stretchable chamber inserted in the stretch device

1.5 鈣成像及ER Tracker Red共聚焦成像 用ACSF輕柔洗滌1～2次，加入含200 g/L聚醚F-127終濃度為 2 μmol/L的Fluo-4 AM，37 ℃避光孵育30 min。用ACSF 37 ℃洗滌20 min后，置于激光共聚焦顯微鏡上觀察檢測。含鈣ACSF配方：(137 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5.6 mmol/L glucose，20 mmol/L HEPES，0.6 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L Na2HPO4，2.0 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2)。無鈣ACSF：(137 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5.6 mmol/L glucose，20 mmol/L HEPES，0.6 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L Na2HPO4, 3.0 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA)。激光共聚焦顯微鏡使用參數(shù)為：激發(fā)光488 nm，出射光505 nm，掃描速度：0.075 μm/像素，512像素/行，間隔2 ms。并用同一細胞在未牽拉情況下的熒光信號為基線。在牽拉損傷后2、5、10、30 min共4個時間點連續(xù)10次掃描，計算10次掃描信號強度的均值為鈣離子相對濃度。計算公式為：△F=[(F-Fb)-(F0-F0b)]/(F0-F0b)，其中F0為損傷前熒光信號值，F(xiàn)b為背景熒光值，F(xiàn)0b為對照組背景熒光值，F(xiàn)為損傷后熒光信號值。

ER Tracker Red共聚焦成像過程與上述過程相似。加入用含20 μmol/L ER Tracker Red的完全培養(yǎng)基，孵育3 min后用完全培養(yǎng)基洗滌2次，置于共聚焦顯微鏡下觀察，測量參數(shù)及計算方法同上。

1.6 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，各時間點上實驗組與對照組的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 原代培養(yǎng)的神經(jīng)元生長狀態(tài)的形態(tài)學觀察、純度及活率鑒定 倒置相差顯微鏡下直接觀察可見，體外培養(yǎng)7～12 d神經(jīng)元之間產生相互連接，軸突間形成十分密集的軸突網(wǎng)，標志著神經(jīng)元已經(jīng)進入V期(stage V)成熟階段(圖3A)。熒光雙標檢測神經(jīng)元純度結果顯示：所培養(yǎng)細胞中神經(jīng)元所占比例為(91.32±4.63)%(圖3B～D)。臺盼藍染色結果顯示神經(jīng)元活率為(97.68±1.21)%。

圖3 原代培養(yǎng)7～12 d神經(jīng)元形態(tài)學觀察及純度鑒定

Fig.3 Morphological observation and purity identification of primary cultured neurons

A：倒置相差顯微鏡下觀察；B：MAP2免疫細胞化學熒光染色(綠色熒光)；C：β-tubulin 免疫細胞化學熒光染色(紅色熒光)；D：MAP2(綠色熒光)+β-tubulin(紅色熒光)+DAPI(藍)熒光合成圖；圖中白色箭頭所示為非神經(jīng)元細胞；標尺=50 μm。

2.2 牽拉損傷后軸突內鈣[Ca2+]i濃度測定與軸突的形態(tài)變化 行牽拉致傷后的神經(jīng)元軸突即刻產生屈曲的形態(tài)學變化；在牽拉損傷后，軸突內[Ca2+]i逐步升高(圖4A～D)。損傷后2 min測量軸突內[Ca2+]i已明顯升高，與損傷前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在隨后的30 min內，軸突[Ca2+]i呈階梯狀升高(圖4G)。牽拉損傷后軸突變性也伴隨著軸突[Ca2+]i的升高而發(fā)生，隨著軸突內[Ca2+]i升高，軸突內的局部區(qū)域具有較高的[Ca2+]i上升部位出現(xiàn)了腫脹，與腫脹部位前后連接的軸突部分出現(xiàn)皺縮，形成了“串珠樣”結構。隨后，腫脹程度進一步加重，進而出現(xiàn)軸突的繼發(fā)性斷裂(圖4E、4F)。

圖4 牽拉損傷后單個軸突的鈣[Ca2+]i濃度變化
Fig.4 Analysis of single axonal calcium concentration after stretch-induced injury
A～D：Fluo-4熒光共聚焦圖，為牽拉損傷前及牽拉損傷后2、10、30 min；E～F：共聚焦顯微鏡透射光成像，分別為牽拉損傷前、牽拉損傷后30 min；G：各時間點的軸突[Ca2+]i結果分析。損傷組與對照組比較，*P<0.05；標尺=50 μm。

2.3 含鈣與無鈣細胞外液條件下細胞內[Ca2+]i濃度的測定 將細胞外液換成不含鈣離子的ACSF，并在牽拉損傷前，預先將細胞在無鈣ACSF下孵育15 min，使[Ca2+]i穩(wěn)定后進一步行牽拉損傷及鈣測量。細胞內[Ca2+]i濃度結果(圖5)顯示，牽拉損傷后2～30 min，細胞處于無鈣的細胞外液環(huán)境中，軸突內[Ca2+]i濃度仍然在牽拉損傷后升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在損傷后2 min，不含鈣細胞外液條件下的軸突內[Ca2+]i升高與含鈣細胞外液條件下軸突內[Ca2+]i升高程度無明顯區(qū)別(P>0.05)，但5～30 min的含鈣ACSF條件下的[Ca2+]i升高程度明顯高于無鈣ACSF條件下的[Ca2+]i升高程度，各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

2.4 ER Tracker Red對軸突部位共聚焦成像 結果顯示ER存在于軸突中(圖6A)；同時發(fā)現(xiàn)ER的熒光強度與軸突的管腔粗細直接相關，直徑較大的軸突具有更多的ER數(shù)量，反之相對直徑較細的軸突則僅具有較少的ER數(shù)量(圖6A)。牽拉損傷后，隨著軸突變性的發(fā)生，ER在軸突腫脹部位發(fā)生聚集(圖6B)。

圖5 不同組間軸突[Ca2+]i濃度變化

Fig.5 Analysis of axonal [Ca2+]iconcentration in different groups與對照組比較，*P<0.05；與損傷+無鈣ACSF組比較，#P<0.05。

2.5 咖啡因誘導的鈣反應 對照組軸突(未進行牽拉致傷)，在20 mmol/L咖啡因作用下，可激活一個快速、劇烈的[Ca2+]i升高(圖7A～C)。而對于牽拉損傷的軸突，在損傷后2 min，進行同樣的20 mmol/L咖啡因干預，其激活的鈣濃度升高相對較低(圖7D～F)，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(圖7G，P<0.05)。

圖6 ER Tracker Red 共聚焦成像

Fig.6 Confocal images of ER Tracker Red

A：軸突部位ER Tracker Red 標記的ER(紅色熒光所示)；B：牽拉損傷后，ER在軸突變性腫脹部位聚集(箭頭所示)。

圖7 咖啡因誘導的鈣反應

Fig.7 Caffeine-induced calcium response

A～C：分別為對照組軸突鈣離子基線濃度、2 min后鈣離子濃度及加入20 mmol/L咖啡因后的鈣離子濃度；D～F：分別為損傷前軸突鈣離子基線濃度、損傷后2 min鈣離子濃度及加入20 mmol/L咖啡因后的鈣離子濃度；G：咖啡因誘導的軸突[Ca2+]i增加幅度(分別與各自基線熒光強度進行比較的倍數(shù))。損傷組與對照組比較，*P<0.05；標尺=50 μm。

3 討 論

本實驗使用細胞牽拉裝置建立了體外的神經(jīng)元軸突牽拉損傷模型，實驗中所使用的細胞牽拉裝置已被廣泛使用于多種其他類型細胞的牽拉損傷的研究中，如平滑肌細胞[14]、心肌細胞[16]、血管內皮細胞[17]、成骨細胞[18]等。本實驗通過使用該裝置對神經(jīng)元細胞進行牽拉致傷，損傷后的軸突表現(xiàn)牽拉所致的屈曲，但并未在損傷后立刻產生神經(jīng)元軸突的斷裂(圖4A、B)，同時牽拉未導致細胞及軸突的脫壁現(xiàn)象；隨后，被牽拉后的軸突表現(xiàn)出一個進行性的腫脹、變性及斷裂過程，符合DAI后軸突的病理學改變(圖4E、F)；同時，牽拉后的軸突內鈣離子濃度明顯升高(圖4C、D)，這點與DAI后的病理生理機制一致[19]，這些證據(jù)充分說明了本實驗建立的模型是可靠的。與其他同類型的DAI細胞模型相比較，該模型由于使用特制硅膠培養(yǎng)皿進行牽拉致傷，可以一次同時牽拉多個神經(jīng)元及其軸突，以滿足如免疫細胞化學、PCR及Western blot 等需要較多細胞數(shù)量完成的實驗研究，同時與DAI動物模型比較，該模型能更好對細胞結構進行損傷后的快速觀察及功能測量。

由于大量研究已經(jīng)證實，DAI后導致軸突繼發(fā)性變性及斷裂的基礎是軸突內鈣離子濃度([Ca2+]i)升高，但對其升高的來源目前仍然不十分清楚。本實驗分別采用了含鈣的細胞外液及無鈣的細胞外液，將細胞分別置于這兩種細胞外液中行牽拉損傷。結果發(fā)現(xiàn)在含鈣細胞外液中，牽拉后的軸突鈣離子濃度明顯升高，并在10 min內呈進行性升高的趨勢。在無鈣的細胞外液中，牽拉損傷并未完全抑制軸突[Ca2+]i升高，說明了細胞內的鈣釋放參與了牽拉損傷后的[Ca2+]i升高；另外，在牽拉后的2 min時間點，無鈣細胞外液及含鈣細胞外液條件下的牽拉損傷所引發(fā)的[Ca2+]i升高程度無明顯差異，說明損傷后2 min左右細胞內鈣釋放是占主導作用的，而5～30 min階段的[Ca2+]i升高則是由細胞內鈣釋放和細胞外鈣內流共同參與的，這與STAAL[11]及IWATA等[4]報道的實驗結果一致。

一直以來，對于DAI后鈣離子濃度升高的機制研究大都是圍繞細胞外鈣離子向細胞內的轉移這一途徑進行闡明，而對ER與外傷乃至其他類型神經(jīng)元損傷、變性疾病的聯(lián)系知之甚少。由于ER是神經(jīng)元內最大的細胞內鈣庫，在維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[20]。目前，對于其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病[21]及亨廷頓病[22]等，ER的鈣釋放都被逐漸證明與疾病的發(fā)生及演進過程關系密切。但在腦外傷方面，ER的鈣釋放是否參與其中仍未被探明。本實驗首先證實了ER存在于神經(jīng)元的軸突結構中，進一步通過咖啡因的使用來判斷牽拉損傷后細胞內鈣釋放的來源是否為ER，結果顯示，對照組軸突(未進行牽拉致傷)在20 mmol/L咖啡因的作用下，可激活一個快速、劇烈的[Ca2+]i升高(圖7A～C)，這種軸突內[Ca2+]i的升高來源于ER的鈣釋放作用，因而間接說明了ER管腔內鈣離子的存量。而對于牽拉損傷的軸突，在損傷后2 min，進行同樣的20 mmol/L咖啡因干預，其激活的鈣離子濃度升高程度明顯低于對照組，說明牽拉損傷后軸突細胞內鈣釋放的細胞器來源是ER。本實驗研究結果證實了ER在DAI后的早期通過釋放鈣離子至軸突胞質，參與了DAI后早期(2～30 min)軸突鈣超載的形成，這對軸突牽拉損傷乃至臨床上DAI的發(fā)病機制是一種新的認識。

由于ER作為神經(jīng)元內的最重要的鈣庫，提供了一個巨大的細胞內鈣存量(ER內鈣離子濃度約為胞漿游離鈣離子濃度的10的4～5次方倍)，在位于ER上的三磷酸肌醇受體 (Inositol 1,4,5-triphosphate receptors, IP3Rs)或雷諾啶受體(Ryanodine receptor, RyRs )被激活后ER內鈣離子可以釋放至胞質[23]。在正常生理狀態(tài)下，神經(jīng)元ER內維持一定濃度的IP3分子，維持神經(jīng)元突觸信號傳遞所需的鈣波(Calcium wave)形成所需的ER鈣離子釋放[24]。但在理化因素刺激下，一些細胞外配體可以增加ER和胞膜對鈣細胞表面受體活化G蛋白，活化的G蛋白水解磷脂酶C(PLC)從而產生大量IP3。IP3與ER表面的IP3R結合，使得ER鈣離子釋放[25]。本實驗中用到的咖啡因，正是RyR受體激動劑的一種，較高濃度的咖啡因可直接激活RyR受體，使得ER內鈣離子迅速釋放。本研究證明了DAI后ER鈣釋放的存在，但并未探明所可能涉及的分子機制，推測可能牽拉損傷作為一個刺激信號，將快速激活細胞內的IP3信號分子的聚集，這種聚集可能是由于機械牽拉作用對膜上G蛋白活化，繼而水解PLC后產生。另一種可能是牽拉損傷將激活牽拉相關通道(stretch activated channels, SAC)，SAC被證實與RyR受體在功能上有藕聯(lián)的關系。即牽拉損傷激活SAC，SAC將激活RyR繼而使得ER鈣釋放，但具體SAC與RyR藕聯(lián)通過何種分子機制，目前還不清楚[26]。

另外，本實驗發(fā)現(xiàn)牽拉損傷后ER在軸突變性腫脹部位聚集。目前對于該病理變化未見其他文獻報道。推測導致這種病理改變的原因可能與牽拉損傷后引起的軸漿運輸中斷有關，軸漿運輸?shù)奈镔|包括各種細胞器結構沿著微管自軸突近端運輸?shù)捷S突末梢，牽拉損傷將導致微管的破壞，從而中斷軸漿運輸過程，這可能是ER在變性的軸突區(qū)域聚集的原因[27]。

總之，我們研究結果證實了DAI后的軸突鈣離子濃度升高不僅由細胞外鈣內流引起，細胞內鈣釋放同樣參與其中，ER是引起這種DAI后軸突內鈣釋放的細胞器來源，ER的鈣釋放參與了軸突牽拉損傷后的[Ca2+]i濃度升高，但抑制這一病理生理過程是否可以減輕損傷后的軸突繼發(fā)性變性或斷裂，本實驗并未闡明。未來對于ER鈣釋放在DAI乃至其他類型腦外傷疾病中的作用值得更為深入、全面的研究。

[1] CHELLY H, CHAARI A, DAOUD E, et al. Diffuse axonal injury in patients with head injuries: an epidemiologic and prognosis study of 124 cases[J]. J Trauma, 2011, 71(4):838-846.

[2] 宋錦寧，劉守勛，戈治理，等. 腦彌漫性軸索損傷的特點及臨床診斷[J]. 中國神經(jīng)精神疾病雜志, 1997, 23(3):141-144, 197.

[3] SMITH DH, MEANEY DF, SHULL WH. Diffuse axonal injury in head trauma[J]. J Head Trauma Rehabil, 2003, 18(4):307-316.

[4] IWATA A, PK S, JA W. Traumatic axonal injury induces proteolytic cleavage of the voltage-gated sodium channels modulated by tetrodotoxin and protease inhibitors[J]. J Neurosci, 2004, 24(19):4605-4613.

[5] 李宇，宋錦寧，閆文濤. DAI后神經(jīng)元鈣離子超載機制的研究現(xiàn)狀及進展[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學雜志, 2012, 11(5):527-530.

[6] WOLF JA, STYS PK, LUSARDI T, et al. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels[J]. J Neurosci, 2001, 21(6):1923-1930.

[7] PARK E, BELL JD, BAKER AJ. Traumatic brain injury: can the consequences be stopped?[J]. CMAJ, 2008, 178(9):1163-1170.

[8] FEI Z, ZHANG X, BAI HM, et al. Posttraumatic secondary brain insults exacerbates neuronal injury by altering metabotropic glutamate receptors[J]. BMC Neurosci, 2007, 8:96.

[9] SPAETHLING J, LE L, MEANEY DF. NMDA receptor mediated phosphorylation of GluR1 subunits contributes to the appearance of calcium-permeable AMPA receptors after mechanical stretch injury[J]. Neurobiol Dis, 2012, 46(3):646-654.

[10] KILINC D, GALLO G, BARBEE KA. Mechanically-induced membrane poration causes axonal beading and localized cytoskeletal damage[J]. Exp Neurol, 2008, 212(2):422-430.

[11] STAAL JA, DICKSON TC, GASPERINI R, et al. Initial calcium release from intracellular stores followed by calcium dysregulation is linked to secondary axotomy following transient axonal stretch injury[J]. J Neurochem, 2010, 112(5):1147-1155.

[12] GEMES G, RIGAUD M, WEYKER PD, et al. Depletion of calcium stores in injured sensory neurons: anatomic and functional correlates[J]. Anesthesiology, 2009, 111(2):393-405.

[13] WHITEHEAD NP, STREAMER M, LUSAMBILI LI, et al. Streptomycin reduces stretch-induced membrane permeability in muscles from mdx mice[J]. Neuromuscul Disord, 2006, 16(12):845-854.

[14] ITO S, MAJUMDAR A, KUME H, et al. Viscoelastic and dynamic nonlinear properties of airway smooth muscle tissue: roles of mechanical force and the cytoskeleton[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006, 290(6):L1227-L1237.

[15] AMMA H, NARUSE K, ISHIGURO N, et al. Involvement of reactive oxygen species in cyclic stretch-induced NF-kappaB activation in human fibroblast cells[J]. Br J Pharmacol, 2005, 145(3):364-373.

[16] MATSUDA T, FUJIO Y, NARIAI T, et al. N-cadherin signals through Rac1 determine the localization of connexin 43 in cardiac myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol, 2006, 40(4):495-502.

[17] KAWAI M, NARUSE K, KOMATSU S, et al. Mechanical stress-dependent secretion of interleukin 6 by endothelial cells after portal vein embolization: clinical and experimental studies[J]. J Hepatol, 2002, 37(2):240-246.

[18] DANCIU TE, ADAM RM, NARUSE K, et al. Calcium regulates the PI3K-Akt pathway in stretched osteoblasts[J]. FEBS Lett, 2003, 536(1-3):193-197.

[19] LI XY, LI J, FENG DF, et al. Diffuse axonal injury induced by simultaneous moderate linear and angular head accelerations in rats[J]. Neuroscience, 2010, 169:357-369.

[20] VERKHRATSKY A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons[J]. Physiol Rev, 2005, 85(1):201-279.

[21] WU J, SHIH HP, VIGONT V, et al. Neuronal store-operated calcium entry pathway as a novel therapeutic target for Huntington's disease treatment[J]. Chem Biol, 2011, 18(6):777-793.

[22] ZEIGER W, VETRIVEL KS, BUGGIA-PREVOT V, et al. Ca2+influx through store-operated Ca2+channels reduces Alzheimer disease beta-amyloid peptide secretion[J]. J Biol Chem, 2013, 288(37):26955-26966.

[23] YOSHIOKA M, YAMAZAKI Y, FUJII S, et al. Intracellular calcium ion dynamics involved in long-term potentiation in hippocampal CA1 neurons in mice lacking the IP3 type 1 receptor[J]. Neurosci Res, 2010, 67(2):149-155.

[24] ROSS WN. Understanding calcium waves and sparks in central neurons[J]. Nat Rev Neurosci, 2012, 13(3):157-168.

[25] RUIZ A, MATUTE C, ALBERDI E. Endoplasmic reticulum Ca2+release through ryanodine and IP3 receptors contributes to neuronal excitotoxicity[J]. Cell Calcium, 2009, 46(4):273-281.

[26] SAVINEAU JP, GILBERT G, DUCRET T, et al. Coupling between stretch-activated channels and ryanodine receptors in vacsular smooth muscle cells[J]. The FASEB J, 2013, 27:922.

[27] TANG-SCHOMER MD, JOHNSON VE, BAAS PW, et al. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury[J]. Exp Neurol, 2012, 233(1): 364-372.

(編輯 國 榮)

Endoplasmic reticulum calcium release contributes to the elevatedintra-axonal calcium concentration after diffuse axonal injury

LI Yu, SONG Jin-ning, ZHANG Ming, AN Ji-yang, SUN Peng,LI Dan-dong, MA Xu-dong, ZHAO Ya-hui

(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To investigate whether calcium release from endoplasmic reticulum (ER) contributes to the elevated axonal calcium concentration in the early stage of diffuse axonal injury (DAI) and discuss the possible molecular mechanisms of this ER calcium release. Methods We used primary cultured neurons of day 7-12 mice to establishinvitroDAI model by axonal stretch-induced injury. ER Tracker Red was used for detecting the ER distribution in axons. In addition, Fluo-4 AM was used to measure the change of axonal calcium concentration after axonal stretch injury. Through caffeine application, calcium stock in ER lumen was investigated indirectly. Results The data of ER Tracker Red fluorescence images demonstrated that ER was present in the axons. And after stretch-induced injury, more ER organelles accumulated in the swollen axonal structures. Axons exhibited a sharp intra-axonal calcium increase after stretch-induced injury. And this increased intra-axonal calcium was associated with axonal swelling, compared with the control group (P<0.05). Zero calcium extracellular buffer did not blunt the intra-axonal calcium increase caused by stretch at 2 min post injury, compared with the normal calcium extracellular buffer group (P>0.05). However, at the other time points post injury, zero calcium extracellular buffer significantly depressed the intra-axonal calcium increase, compared with the normal calcium extracellular buffer group (P>0.05). Furthermore, 20 mmol/L caffeine triggered a huge and quick calcium increase in the axons of the control group. But for axons which had been stretched in advance, 20 mmol/L caffeine only triggered a relatively smaller calcium increase, compared with the control group (P<0.05). Conclusion Extracellular calcium influx is not the only mechanism which results in the elevated concentration of axonal intracellular calcium. Intracellular calcium release also plays a role. And ER is the source of this intracellular calcium release.

traumatic brain injury; diffuse axonal injury; calcium; endoplasmic reticulum

2014-04-21

2014-06-28

國家自然科學基金資助項目(No.30471774)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學基金資助項目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師. E-mail: jinnings@126.com

李宇(1986-)，男(漢族)，博士研究生在讀. 研究方向：腦外傷的基礎及臨床. E-mail: liyuwood@gmail.com

時間：2014-09-16 11∶34 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140916.1134.005.html

R651.1+5

A

10.7652/jdyxb201406002