黃廷欽，宋錦寧，李 宇，胡明軍，趙雅慧，鄭鋒偉，郭小葉，金 濤

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

◇專題研究◇

DAPK1在彌漫性軸索損傷后大鼠腦組織中的表達及其與神經(jīng)元凋亡的關系

黃廷欽，宋錦寧，李 宇，胡明軍，趙雅慧，鄭鋒偉，郭小葉，金 濤

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

目的 探討大鼠彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)后神經(jīng)元凋亡及死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)表達變化，為臨床治療提供新的靶點及治療時間窗。方法 40只SD成年雄性大鼠隨機分為對照組(n=8)和DAI組(n=32)。DAI組選用大鼠頭顱瞬間旋轉裝置制備DAI模型，分為6 h、24 h、72 h、7 d組共4個亞組(n=8)。各組在造模前及處死前采用改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)對大鼠神經(jīng)功能進行評分；同時將各組大鼠一半用于Western bolt檢測大鼠胼胝體、腦干組織內DAPK1表達情況；另一半用于TUNEL檢測大鼠腦組織內神經(jīng)元細胞凋亡情況。結果 DAI后大鼠均出現(xiàn)明顯體質量下降、神經(jīng)功能缺失；DAI后6 h組大鼠胼胝體、腦干組織可見DAPK1蛋白表達明顯升高，并出現(xiàn)明顯神經(jīng)元細胞凋亡，DAI后24 h組DAPK1表達及神經(jīng)元細胞凋亡均到達高峰值，DAI后72 h、7 d組表達開始下降，仍明顯高于對照組。結論 DAI后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失、體質量下降，可能與損傷后DAPK1表達及神經(jīng)元細胞凋亡有關，二者在損傷后24 h一致性達到高峰；提示DAPK1抑制劑藥物治療時間窗為傷后24 h。

彌漫性軸索損傷；死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)；神經(jīng)元凋亡

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)是一種常見的特殊類型的腦外傷(traumatic brain injury, TBI)，典型表現(xiàn)為長時間意識障礙，臨床診斷較困難且預后差。目前，已在動物模型、臨床患者中證實急性顱腦創(chuàng)傷后存在神經(jīng)元凋亡[1]；創(chuàng)傷后神經(jīng)元凋亡的機制復雜，盡管目前國內外的研究對腦損傷后神經(jīng)元凋亡有了進一步的認識，發(fā)現(xiàn)其涉及鈣超載[2]、Mdm2/p53[3]、亞硝化應激(nitrosative stress)[4]、氧化應激(oxidative stress)[5]、線粒體功能障礙[2,6]等多個方面，但是尚未完全闡明其病理演變過程及發(fā)生機制。在治療方面，CLARK等[7]發(fā)現(xiàn)向顱腦外傷模型大鼠鞘內注射Caspase-3抑制肽能夠明顯降低顱腦外傷后的神經(jīng)元凋亡及腦組織損失；但長期神經(jīng)功能未見明顯改善。

死亡相關蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)家族是一簇具有促細胞凋亡作用的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在機體中廣泛參與由多種信號介導的細胞死亡過程；DAPK1作為細胞凋亡正調控因子，可通過上調p53基因的表達而促使細胞進入Ⅰ型細胞凋亡程序，也可與非p53依賴的經(jīng)典凋亡途徑發(fā)生關聯(lián)[8]；也有研究發(fā)現(xiàn)DAPK1亦可誘導一種不需要半胱天冬酶參與的Ⅱ型細胞死亡或稱自體吞噬性細胞死亡[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)DAPK1與BimEL、ERK1/2、NMDA-NR2b及JNK1/2等下游分子共同介導腦缺血后神經(jīng)元死亡的新的信號轉導通路[10-12]。本實驗通過觀察DAI后不同時間段大鼠腦組織內DAPK1蛋白表達的變化情況及腦神經(jīng)元細胞凋亡情況，探討DAPK1對大鼠DAI損傷后神經(jīng)元凋亡的影響，旨在為DAI的臨床治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 成年健康雄性SD大鼠40只，體質量(300±20)g(由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)；DAPK1兔單克隆抗體(美國Abcom公司)；β-actin鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；DeadEnd TUNEL比色法檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)；Western blot試劑盒(美國Cybrdi公司)；圖像采集及分析系統(tǒng)(德國Leica-Q550CW)。

1.2 分組及DAI模型制作 健康大鼠隨機分為2組：DAI組(n=32)、對照組(n=8)；DAI組又分為：損傷后6 h組、24 h組、72 h組、7 d組(各組n=8)。本實驗動物倫理經(jīng)西安交通大學醫(yī)學部生物倫理委員會批準。

采用劉曉斌等[13]研制的大鼠頭顱瞬間旋轉損傷裝置制備大鼠DAI模型，步驟簡述如下：大鼠稱重后給予淺麻醉(100 g/L水合氯醛，按2.0 mL/kg腹腔內注射)，頭部固定于頭顱瞬間旋轉損傷裝置，并調整軀干位置使之與實驗臺面間夾角保持約30°，按動扳機，使大鼠頭顱瞬間旋轉90°后又瞬間停止，隨后復位裝置，重復8次。對照組給予麻醉并固定于裝置，但不打擊損傷。損傷后大鼠置于單獨籠子內，保持室溫18～26 ℃，室內相對濕度40%～70%。造模后制作腦組織切片并行鍍銀染色判斷造模是否成功。

1.3 大鼠體質量變化及神經(jīng)功能的評估 觀察各組大鼠的體質量變化情況；體質量變化以手術當天(第0天)體質量為初始基礎體質量，連續(xù)記錄每天體質量變化至各組大鼠結束實驗處死取腦(最長為術后第7天)。

采用改良神經(jīng)功能缺損程度評分(modified neurological severity scores, mNSS)[14]，在對照組及DAI組大鼠造模前及處死前，對大鼠神經(jīng)功能進行評分。mNSS評分包括：運動、感覺、反射及平衡木4項 測試，其中運動試驗包括提尾試驗及平地運動試驗，感覺試驗包括放置試驗和本體感覺試驗，反射消失或不正常運動包括耳廓反射、角膜反射、驚恐反射消失及出現(xiàn)抽搐、肌陣攣、肌張力障礙。記分在0～18分之間(0分正常，最大神經(jīng)功能缺損18分)。評分人員為兩位未知分組情況的實驗員。

1.4 Western blot檢測大鼠腦組織DAPK1表達 大鼠用水合氯醛麻醉后，用生理鹽水250 mL經(jīng)心臟充分灌注，斷頭取腦，冰上分離雙側大腦半球、腦干、小腦組織，收集腦干組織；雙側大腦半球OCT包埋、―80 ℃冰凍后，冠狀方向連續(xù)1 mm切片后，將包含胼胝體腦組織切片沿胼胝體邊界切取胼胝體，收集胼胝體標本；腦干、胼胝體組織用RIPA細胞裂解液冰上裂解、離心，取上清液―20 ℃凍存，備用。

將提取的大鼠腦組織蛋白定量分析、蛋白質變性后，按每泳道加20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后經(jīng)半干轉印跡法轉移至硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂牛奶(TBST液配制)封閉1 h后加入1∶1 000稀釋DAPK1一抗，4 ℃孵育過夜。TBST液洗膜3次×10 min后加入辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育2 h，再次TBST液洗膜4次×10 min后與顯色劑(A液∶B液=1∶1)于暗盒內反應5 min，后經(jīng)膠片顯影成像、自動凝膠圖像分析儀拍照(上海培清科技JS-380A)，以MediaCybernetics公司Image-Pro Plus v6.0分析軟件系統(tǒng)進行蛋白條帶的灰度值分析。以目的蛋白DAPK1與內參β-actin比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.5 Gless-Marsland鍍銀染色及TUNEL檢測大鼠神經(jīng)元細胞凋亡情況 大鼠用水合氯醛麻醉后依次用生理鹽水、40 g/L多聚甲醛各250 mL經(jīng)心臟灌注，斷頭取腦，再經(jīng)后固定、漂洗、脫水并透明后石蠟包埋。每個腦組織塊在大腦腳水平離斷腦干與間腦部分，去除小腦組織。將大腦沿正中分為左右半球，隨機選取一側半球，分別在中線位置外2 mm連續(xù)縱切5 μm厚腦片4片；沿大腦腳水平下1 mm連續(xù)橫切5 μm厚腦片4片，各切片經(jīng)脫臘、脫水后用于Gless-Marsland鍍銀染色及TUNEL染色。

TUNEL染色方法：切片經(jīng)二甲苯脫臘、乙醇水化、PBS水洗后用蛋白酶K溶液(20 μg/mL)去除組織蛋白，加100 μL TUNEL反應混合液(處理組用1 μL rTdT+1 μL生物素標記的dUTP+98 μL平衡液混勻)于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×1h，而陰性對照組不加rTdT，改為三蒸水，陽性對照組先加入100 μL DNase 1緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 μL DNase 1(10 U/mL)酶切10 min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min；浸入2×SSC 15 min終止反應；切片用PBS洗3次后滴加內源性過氧化物酶POD封閉，浸入3 mL/L H2O23～5 min；PBS 洗滌3次后滴加100 μL streptavidin標記HRP(按1：500 PBS稀釋)30 min；PBS 洗滌3次后DAB顯色(避光)，加100 μL DAB混合液[(50 μL DAB+50 μL DAB底物緩沖液+50 μL H2O2(20×)+950 μL三蒸水)]10 min左右，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時，用蘇木素復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200～500個細胞)并拍照。

可結合凋亡細胞形態(tài)特征進行綜合判斷。每張切片在高倍鏡下選取胼胝體、皮層或腦干位置各5個不重復的視野計數(shù)陽性細胞，10(胼胝體+皮層)或5(腦干)個視野總數(shù)相加為該切片陽性細胞數(shù)，同一組織部位3張切片平均值為該位置陽性細胞數(shù)，3個位置相加為該動物總陽性細胞數(shù)，最后取每組4只動物的平均值。

2 結 果

2.1 Gless-Marsland鍍銀染色 鍍銀染色能夠很好顯示神經(jīng)軸突的病理改變。對照組大鼠腦組織光鏡下鍍銀染色可見腦白質、腦干區(qū)域神經(jīng)軸索走行自然、光滑、粗細均勻及排列緊密。而DAI組在大鼠胼胝體、腦干、小腦等腦白質區(qū)域可見迂曲腫脹的軸突，甚至出現(xiàn)軸索斷裂、軸索球的形成(圖1)。出現(xiàn)以上結果提示DAI模型造模成功，可進行后續(xù)實驗。

圖1 DAI組大鼠神經(jīng)軸索迂曲腫脹、軸索球(黑色箭頭)形成

Fig.1 The axon became varicose and swollen and axonal retraction ball (black arrow) formed in DAI group (×200)

2.2 神經(jīng)功能缺損評分 DAI組大鼠在造模后均出現(xiàn)不同程度的意識障礙。少數(shù)大鼠原發(fā)性深昏迷，表現(xiàn)為刺痛反射、驚恐反射、羽翼反射、復位反射均消失、瞳孔直接或間接對光反射遲鈍。時間持續(xù)約45 min～2 h后意識狀態(tài)明顯改善。其他大鼠昏迷較淺，表現(xiàn)為復位反射較損傷前減慢，刺痛反射、驚恐反射、羽翼反射均有減弱或消失，瞳孔直接或間接對光反射遲鈍，持續(xù)時間約幾分鐘至數(shù)十分鐘之后，表現(xiàn)明顯恢復。所有大鼠清醒后行為表現(xiàn)活動減少，反應遲緩，行走不穩(wěn)，不能抓住橫木，易掉下，平衡能力減弱持續(xù)數(shù)小時至數(shù)日。對照組大鼠假損傷后6 h部分大鼠平衡受損，表現(xiàn)為走路不穩(wěn)，抓住橫木不久后掉下，但感覺及反射檢測均正常，數(shù)小時或數(shù)天后恢復。評分結果顯示：DAI組在損傷后6 h mNSS評分明顯升高，神經(jīng)功能缺損到達峰值；損傷后24 h、72 h、7 d神經(jīng)功能有所恢復，仍未到達對照組水平。DAI各組與對照組神經(jīng)功能缺損評分值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。

2.3 DAI后大鼠體質量的變化 DAI后可由于腦水腫、胃腸功能減低、運動功能障礙等原因導致食物及飲水需求或攝入減少，體質量出現(xiàn)不同程度下降，DAI組在損傷后出現(xiàn)了顯著的體質量下降且持續(xù)至第7天，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2)。

表1 各組大鼠mNSS評分

Tab.1 The results of mNSS in each group (±s)

與對應時間點的對照組比較，**P<0.01。

圖2 各組損傷前后大鼠體質量的變化

Fig.2 Weight records before or after injury

對照組假損傷后體質量隨時間逐漸增高，#P<0.05；DAI組與對照組比較體質量明顯減低，**P<0.01。

2.4 各組腦組織的細胞凋亡情況 TUNEL染色可見凋亡細胞形態(tài)特征：未染色細胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體；而染色細胞呈現(xiàn)染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀；結果顯示胼胝體、皮層、腦干組織在對照組中未見明顯陽性細胞或僅有少量；DAI組在損傷后6 h陽性細胞開始明顯增多，24 h可見陽性細胞數(shù)量達到高峰值；一直持續(xù)到第7天，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，可見損傷后各時間點腦干組織陽性細胞數(shù)較胼胝體組織多，可能與胼胝體內神經(jīng)元數(shù)目較少有關(圖3、圖4)。

2.5 DAPK1蛋白表達及相關因素分析 大鼠DAI損傷后胼胝體組織內DAPK1的表達量在傷后6 h開始明顯增多，24 h達到高峰，一直持續(xù)到第7天，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。而腦干組織內DAPK1表達量亦在傷后6 h開始明顯增多，在傷后24 h達到高峰并一直持續(xù)到第7天，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。

DAI各組相關性分析結果顯示，TUNEL陽性細胞計數(shù)、神經(jīng)功能缺損評分與DAPK1表達呈正相關(圖5)。

3 討 論

DAI是指在頭部遭受特殊鈍性外力作用下，顱內腦組織在不均一的加速、減速或旋轉運動下，由于剪切力的影響，腦內廣泛發(fā)生的以神經(jīng)軸索變性、斷裂、軸索回縮球形成為主要病理特征改變的顱腦外傷[15]。相關病理學研究發(fā)現(xiàn)DAI損傷后軸索易損傷，尤其是軸索密集區(qū)域，如胼胝體、腦干，其次為皮層、海馬等區(qū)域[16]。腦干網(wǎng)狀結構具有維持生物醒覺的功能，因而軸索損傷的程度將嚴重影響著意識障礙的程度，與臨床嚴重的意識障礙相一致。劉曉斌等[13]研制的大鼠頭顱瞬間旋轉損傷模型致傷穩(wěn)定，可控性與可重復性高，動物致死率低，特異性強，顱腦損傷多呈彌漫性分布，造模后更貼近臨床DAI患者病理生理機制。本實驗采用該方法進行DAI打擊后，大鼠均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失，能夠較正確反映DAI后繼發(fā)性神經(jīng)元損傷導致的腦功能障礙。

急性顱腦創(chuàng)傷造成的應激反應，顱腦外傷后大鼠處于高代謝、高分解及激素水平異常的代謝病理狀態(tài)，而且顱腦外傷后腦組織水腫、低灌注狀態(tài)及胃腸道功能損害等因素，以及損傷后不同程度的神經(jīng)功能缺失(行為、感覺、平衡及反射異常)，導致大鼠傷后營養(yǎng)攝入不足，機體處于負氮平衡狀態(tài)，出現(xiàn)不同程度體質量下降，有研究者認為腦外傷后體質量變化及恢復時間可作為判斷顱腦損傷后腦功能恢復狀態(tài)的指標[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)損傷后急性期體質量下降明顯，而損傷后7 d仍未見明顯恢復，結合觀察DAI損傷后大鼠mNSS評分發(fā)現(xiàn)，該階段仍具有明顯的神經(jīng)功能缺失，因此體質量繼續(xù)下降的原因可能與顱腦損傷后神經(jīng)功能缺失導致的攝入不足有關，且神經(jīng)功能缺失越嚴重，體質量下降越多，機體的負氮平衡狀態(tài)越重，進而加重神經(jīng)功能損害，進入惡性循環(huán)。本實驗提示DAI后體質量變化指標及恢復情況可作為判斷腦損傷后腦功能恢復狀況的指標，加強顱腦損傷患者的營養(yǎng)支持、維持正常機體內環(huán)境有助于損傷后神經(jīng)功能的恢復。但明確損傷后長期神經(jīng)功能恢復程度及體質量能否恢復正常生理水平，還需進一步延長觀察時間。

DAI造成外傷后的腦功能障礙不僅由于最初的機械外力等作用所致的原發(fā)性損傷，很大程度上與損傷后發(fā)生的復雜的神經(jīng)元“二次打擊”(繼發(fā)性神經(jīng)元損傷、死亡)有關[18]。機械性顱腦損傷后造成腦組織缺血、壞死及腦血管的損傷，造成繼發(fā)性神經(jīng)元損傷(水腫、低灌注狀態(tài))[19]，如果在一定時間內不能改善，將逐漸發(fā)展為繼發(fā)性神經(jīng)元死亡[20]；繼發(fā)性神經(jīng)元死亡是影響患者病情及預后的重要因素，如何預防、降低繼發(fā)性腦損傷的程度是整個DAI治療過程十分關鍵的步驟。以往認為壞死是造成腦損傷繼發(fā)性細胞死亡的主要原因，目前已有動物實驗證實急性顱腦創(chuàng)傷后存在神經(jīng)元細胞凋亡，本研究TUNEL染色顯示DAI后神經(jīng)細胞于傷后6 h開始出現(xiàn)細胞凋亡，在傷后24 h達到神經(jīng)細胞凋亡高峰，隨后下降，直至損傷后7 d仍高于對照組。

圖3 各組大鼠胼胝體、腦干、皮質TUNEL染色

Fig.3 The TUNEL staining of the corpus callosum, brain cortex and brain stem in each group

A：大腦隨機半球中線旁縱切面，可見越靠近胼胝體位置，凋亡陽性細胞表達越多，三角形示胼胝體(B)，正方形示皮層(C)；B：胼胝體；C：腦皮層；D：腦干中腦水平橫斷面，于圓圈處觀察腦干(E)；E：腦干區(qū)域(A、D： ×40，B、C、E：×400)。

正常狀態(tài)下DAPK1沒有活性，當細胞受到各種“死亡信號”的刺激時，首先DAPK1去磷酸化激活，然后將與其高度同源性蛋白ZIPK磷酸化，從而使得磷酸化ZIPK滯留在細胞質內，通過p53途徑或非p53途徑以及自體吞噬性作用、膜出泡作用促細胞凋亡。DAPK1多在細胞凋亡信號轉導途徑中位于Caspase-3及p53上游[21]；在腦缺血腦損傷中證實與DAPK1密切相關，DAPK1與谷氨酸受體NMDA-NR2b亞單位結合介導神經(jīng)興奮毒性及鈣超載損傷，同時DAPK1還可以通過介導自噬、膜出泡、DNA鏈斷裂等最終導致神經(jīng)細胞的死亡[22]。本研究結果顯示DAI組大鼠的胼胝體、腦干組織內DAPK1表達在損傷后6 h開始明顯增多，傷后24 h達到高峰，隨后緩慢下降，直至損傷后7 d仍高于對照組。其表達變化規(guī)律與TUNEL染色呈直線相關關系。提示DAPK1與DAI后神經(jīng)元凋亡相關，可能是調控顱腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡新的調節(jié)分子或催化因子，對其催化功能的抑制性藥物的研究可能成為DAI后神經(jīng)功能保護的治療靶點，且最佳治療時間可能為損傷后24 h以內。因此，選用抑制DAPK1的活性藥物，將有效逆轉DAI后神經(jīng)細胞死亡，利于神經(jīng)功能恢復。

圖4 各組胼胝體、腦干、皮層部位的TUNEL染色陽性細胞(A)及腦組織總陽性細胞(B)的變化情況

Fig.4 The number of TUNEL staining positive cells (A) in the corpus callosum, brain cortex and brain stem and the total positive cells (B) in brain tissues in each group

與對照組比較，*P<0.05。

圖5 各組大鼠腦組織中DAPK1蛋白表達情況及相關性分析

Fig.5 The protein expression of DAPK1 in rat brain in all groups and correlation analysis

A：DAPK1 的Western blot檢測結果；B：定量分析各組DAPK1在胼胝體、腦干組織內蛋白表達，與對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01，##P<0.01。C：TUNEL陽性細胞計數(shù)與腦組織DAPK1表達的相關性；D：神經(jīng)功能缺損評分與腦組織DAPK1表達的相關性。

[1] MINAMBRES E, BALLESTEROS MA, MAYORGA M, et al. Cerebral apoptosis in severe traumatic brain injury patients: aninvitro,invivo, and postmortem study[J]. J Neurotrauma, 2008, 25(6):581-591.

[2] HANSSON MJ, PERSSON T, FRIBERG H, et al. Powerful cyclosporin inhibition of calcium-induced permeability transition in brain mitochondria[J]. Brain Res, 2003, 960(1-2):99-111.

[3] XU J, JIN W, WU X, et al. Up-regulation of Che-1 relates to neuronal apoptosis after traumatic brain injury in adult rats[J]. Cell Mol Neurobiol, 2013, 33(1):85-97.

[4] AARTS M, IIHARA K, WEI WL, et al. A key role for TRPM7 channels in anoxic neuronal death[J]. Cell, 2003, 115(7):863-877.

[5] UEHARA T, NAKAMURA T, YAO D, et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration[J]. Nature, 2006, 441(7092):513-517.

[6] 劉健，楊小玉，董健，等. Bcl-2蛋白與細胞凋亡的關系及其在中樞神經(jīng)損傷修復中作用的研究進展[J]. 吉林大學學報：醫(yī)學版, 2012, 38(3):603-606.

[7] CLARK RS, KOCHANEK PM, WATKINS SC, et al. Caspase-3 mediated neuronal death after traumatic brain injury in rats[J]. J Neurochem, 2000, 74(2):740-753.

[8] WANG WJ, KUO JC, YAO CC, et al. DAP-kinase induces apoptosis by suppressing integrin activity and disrupting matrix survival signals[J]. J Cell Biol, 2002, 159(1):169-179.

[9] SHANI G, MARASH L, GOZUACIK D, et al. Death-associated protein kinase phosphorylates ZIP kinase, forming a unique kinase hierarchy to activate its cell death functions[J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(19):8611-8626.

[10] HE C, STROINK AR, WANG CX. The role of DAPK-BimEL pathway in neuronal death induced by oxygen-glucose deprivation[J]. Neuroscience, 2014, 258:254-262.

[11] PLESNILA N, VON BAUMGARTEN L, RETIOUNSKAIA M, et al. Delayed neuronal death after brain trauma involves p53-dependent inhibition of NF-kappaB transcriptional activity[J]. Cell Death Differ, 2007, 14(8):1529-1541.

[12] TU W, XU X, PENG L, et al. DAPK1 interaction with NMDA receptor NR2B subunits mediates brain damage in stroke[J]. Cell, 2010, 140(2):222-234.

[13] 劉曉斌，宋錦寧，陳景宇，等. 腦彌漫性軸索損傷實驗裝置的研制及動物模型的建立[J]. 西安交通大學學報：醫(yī)學版, 2008, 29(5):595-598.

[14] CHEN J, SANBERG PR, LI Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J]. Stroke, 2001, 32(11):2682-2688.

[15] POVLISHOCK JT, KATZ DI. Update of neuropathology and neurological recovery after traumatic brain injury[J]. J Head Trauma Rehabil, 2005, 20(1):76-94.

[16] YAMAKI T, MURAKAMI N, IWAMOTO Y, et al. Pathological study of diffuse axonal injury patients who died shortly after impact[J]. Acta Neurochir (Wien), 1992, 119(1-4):153-158.

[17] HAMM RJ. Neurobehavioral assessment of outcome following traumatic brain injury in rats: an evaluation of selected measures[J]. J Neurotrauma, 2001, 18(11):1207-1216.

[18] 周衛(wèi)京. 早期高壓氧治療彌漫性軸索損傷臨床分析[J]. 吉林大學學報：醫(yī)學版, 2012, 38(2):381-381.

[19] STRUFFERT T, AXMANN C, REITH W. Craniocerebral trauma. 2: Intra-axial injuries, secondary injuries[J]. Radiologe, 2003, 43(11):1001-1014, 1015-1016.

[20] WANG YQ, WANG L, ZHANG MY, et al. Necrostatin-1 suppresses autophagy and apoptosis in mice traumatic brain injury model[J]. Neurochem Res, 2012, 37(9):1849-1858.

[21] SHAMLOO M, SORIANO L, WIELOCH T, et al. Death-associated protein kinase is activated by dephosphorylation in response to cerebral ischemia[J]. J Biol Chem, 2005, 280(51):42290-42299.

[22] NAIR S, HAGBERG H, KRISHNAMURTHY R, et al. Death associated protein kinases: molecular structure and brain injury[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(7):13858-13872.

(編輯 國 榮)

Expression of death-associated protein kinase 1 and its relationshipwith neuron apoptosis following diffuse axonal injury in rats

HUANG Ting-qin, SONG Jin-ning, LI Yu, HU Ming-jun,ZHAO Ya-hui, ZHENG Feng-wei, GUO Xiao-ye, JIN Tao

(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the change of death-associated protein kinase 1 (DAPK1) expression and neuron apoptosis so as to provide a therapeutic time window for diffuse axonal injury in rats. Methods Totally 40 adult male SD rats were randomly divided into control group (n=8) and DAI groups (n=32). The model of DAI was produced by instant head rotation, and the model group was further divided into 4 subgroups, with 8 rats in each: 6 h, 24 h, 72 h and 7 d. Rats in each group were evaluated for the modified neurological severity score (mNSS) before injury and before sacrifice. Meanwhile half of the rats in each group were used to assay the expression of DAPK1 in the corpus callosum and the brain stem after DAI by Western blot, while the other half were used to detect the brain neuron apoptosis after DAI. Results There were obvious weight loss and neurological deficit in the rats after DAI. At 6 h after brain injury, the expression of DAPK 1 increased obviously and obvious neuron apoptosis was observed. At 24 h after injury, both the expression of DAPK1 and neuron apoptosis reached the peak. However, they began to decrease at 72 h and 7d after injury, but were still higher than those in control group. Conclusion Weight decrease and neurological deficit in the rats after DAI may be related to the expression of DAPK1 and neuron apoptosis after DAI, both of which reached the peak at 24 h after injury. It suggested that the optimum therapeutic time window of DAPK1 inhibitors was 24 h after DAI.

diffuse axonal injury; death-associated protein kinase 1; neuron apoptosis

2014-04-21

2014-08-25

國家自然科學基金資助項目(No.30471774)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學基金資助項目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師. E-mail: jinnings@126.com

黃廷欽(1988-)，男(漢族)，博士研究生在讀，研究方向：腦血管病、腦外傷基礎及臨床. E-mail: htqno.1@stu.xjtu.edu.cn

時間：2014-10-15 14∶31 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141015.1431.001.html

R651.1

A

10.7652/jdyxb201406008