趙永林，宋錦寧，馬旭東，張斌飛，張 明，李丹東，龐宏剛，羅顯華

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，陜西西安 710061)

◇專題研究◇

大鼠彌漫性軸索損傷后海馬區(qū)caveolin-1的表達及其與星形膠質細胞活化的關系

趙永林，宋錦寧，馬旭東，張斌飛，張 明，李丹東，龐宏剛，羅顯華

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，陜西西安 710061)

目的 研究大鼠彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)后小窩蛋白1(caveolin-1)在大鼠腦海馬區(qū)的表達，探討caveolin-1的表達變化與星形膠質細胞活化的關系。方法 運用Western blot檢測大鼠海馬中caveolin-1的表達，運用免疫組化檢測海馬區(qū)膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表達，并通過免疫熒光共定位分析caveolin-1與GFAP之間的相互作用。結果 Western blot結果提示DAI后海馬區(qū)caveolin-1的表達從1 d開始顯著降低，并持續(xù)降低至7 d(P<0.05)；免疫組化結果提示DAI后星形膠質細胞活化標志物GFAP的表達從1 d后逐漸升高，3 d后達峰，7 d后稍降低，但仍高于正常(P<0.05)；免疫熒光共定位提示DAI后caveolin-1與GFAP的共定位細胞數隨著時間的延長逐漸增加。結論 大鼠DAI后海馬區(qū)caveolin-1的表達減少，GFAP的表達增加，星形膠質細胞內caveolin-1的表達變化可能是導致GFAP升高及星形膠質細胞活化的機制之一。

彌漫性軸索損傷；小窩蛋白1；星形膠質細胞活化；海馬；大鼠

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)后星形膠質細胞出現(xiàn)反應性活化，其活化包括生物分子表達、進行性的細胞肥大、增生和瘢痕形成等，且隨著病損的性質和嚴重程度呈現(xiàn)連續(xù)的、有梯度的和進行性的改變，這些改變的性質和程度是由特定的分子信號級聯(lián)調控的，可能使星形膠質細胞失去部分功能，同時獲得一些新功能，繼而對周圍的神經細胞和非神經細胞產生正面效應和負面效應[1-2]。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是星形膠質細胞活化的標志物，盡管研究者對星形膠質細胞活化尤其是GFAP的表達增加有深入的研究，但具體機制仍不明確[3]。小窩(caveolae)是細胞質膜內陷所形成的特化的囊狀結構，主要由蛋白質和脂類組成。小窩蛋白-1(caveolin-1)是小窩的主要結構和調節(jié)成分，參與膽固醇平衡、分子運輸和跨膜信號發(fā)生。caveolin-1能與多種關鍵性信號分子如G蛋白α亞單位、Ha-Ras、酪氨酸激酶家族成員(Src、Fyn等)、EGF受體、胰島素受體、PKC和eNOS等連接，對信號分子的活性狀態(tài)起直接調控作用，尤其是負性調控作用，從而參與細胞的生長、發(fā)育和增殖、炎癥、衰老等多種病理生理過程[4-5]。由于caveolin-1在DAI后星形膠質細胞活化中的作用尚不明確，本研究采用頭顱瞬間旋轉損傷裝置建立大鼠DAI模型觀察DAI后海馬組織caveolin-1的變化趨勢，探討caveolin-1在星形膠質細胞活化中的作用，以揭示DAI后星形膠質細胞活化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑儀器 相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠60只，體質量250～300 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK(陜)08-018，該實驗倫理經西安交通大學醫(yī)學部生物醫(yī)學倫理委員會批準。細胞膜蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific，美國)；caveolin-1兔單克隆抗體(Abcam，美國)；GFAP鼠單克隆抗體(Santa Cruz，美國)；辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(Santa Cruz，美國)；FITC、CY3標記的羊抗兔/鼠熒光二抗(博奧森，中國)；PVDF膜(Millipore，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(JS-380A，中國)；圖像采集與分析系統(tǒng)(Leica-Q550CW，德國)；熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)；SPSS16.0統(tǒng)計軟件(美國)。

1.2 實驗動物分組 選取健康成年雄性SD大鼠，隨機分為正常組、假手術組和模型組，正常組及假手術組各12只，模型組又分為傷后1、3、7 d三個亞組,每亞組12只。

1.3 大鼠DAI模型的建立 采用劉曉斌等[6]研制的大鼠頭顱瞬間旋轉損傷裝置制備大鼠DAI模型：各組大鼠經100 g/L水合氯醛麻醉(0.2～0.3 mL/100 g)后，固定于旋轉裝置上。模型組大鼠蘇醒后出現(xiàn)較劇烈掙扎，在掙扎間歇期，按動扳機，致其頭顱瞬間旋轉90°，重復8次。假手術組大鼠蘇醒后即從裝置上卸下。模型組在預定時間、正常組在觀察6 h后，用100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，快速開胸，左心室插管至主動脈，灌注9 g/L生理鹽水至流出液清亮后，換40 g/L多聚甲醛溶液灌注，灌注完成后迅速取腦。

1.4 大鼠神經行為學評分 各組大鼠于術后1 d、3 d及7 d按改良神經功能缺失程度評分表(modified neurological severity score, mNSS)評估大鼠神經功能缺損。mNSS包括運動、感覺、平衡、反射等檢測，總分為18分，得分越高，腦損傷程度越重[7-8]。

1.5 HE染色 各組大鼠于預定時間點灌注生理鹽水及40 g/L多聚甲醛后取腦，標本置于多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定48 h。常規(guī)石蠟包埋，每個蠟塊連續(xù)切片厚4 μm，脫蠟、梯度乙醇水化后染色：將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色，酸水及氨水中分色，流水沖洗1 h后入蒸餾水，入700 mL/L和900 mL/L乙醇脫水，入乙醇伊紅染色液染色，染色后的切片常規(guī)脫水、透明、封片，于Leica-Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)上采集、分析圖片。

1.6 免疫組織化學法檢測 取石蠟切片，脫蠟如前，高壓修復抗原。山羊血清室溫封閉30 min后，滴加鼠單克隆抗GFAP抗體(1∶200)，4 ℃過夜。生物素化二抗37 ℃孵育30 min后，辣根酶標記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min。DAB顯色、蘇木素溶液復染，脫水、封片。光鏡下觀察，Leica-Q550CW圖像分析系統(tǒng)采集圖像。每張切片隨機選取6個視野(×200)，Image-Pro Plus 6.0對GFAP進行免疫組化半定量分析。

1.7 免疫熒光染色 取石蠟切片，脫蠟、抗原修復如前。滴加PBS稀釋過的正常山羊血清封閉液，室溫封閉20 min。滴加兔多克隆抗caveolin-1(1∶100)，鼠單克隆抗GFAP(1∶100)，4 ℃過夜，PBS洗片3次，每次5 min。滴加FITC、CY3標記的抗兔/鼠熒光二抗(1∶100)，室溫避光孵育2 h，PBS洗片3次，每次5 min。甘油緩沖液封片，于熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。用photoshop cs5對熒光照片進行合成。

1.8 Western blot檢測蛋白表達 各組大鼠于預定時間點灌注取腦，取海馬，加入裂解液制成組織勻漿，用Bio-Rad試劑盒測定蛋白含量，蛋白煮沸變性后取50 μg蛋白樣品，用SDS-PAGE電泳半干法轉移至PVDF膜，將膜放入50 g/L脫脂牛奶中，37 ℃封閉2 h，加入一抗caveolin-1(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，將膜與辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG(1∶5 000)和抗鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜3次，用增強化學發(fā)光法觀察顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One 4.6軟件作定量分析。

2 結 果

2.1 DAI后組織病理學的改變 HE染色觀察：假手術組皮層及海馬神經元形態(tài)結構完整，膠質細胞分布正常；DAI后1 d皮層及海馬神經元腫脹，體積增大，核膜不清，核仁深染、偏位或消失，核固縮，僅顯示細胞核輪廓或無細胞核，胞質和胞核黏附，深染的固縮神經元數目明顯增多，神經細胞周圍出現(xiàn)空隙(圖1)。

圖1 假手術組與DAI組腦皮質及海馬組織的形態(tài)學改變

Fig.1 Microscopic observation of the brain cross-sections of control rats and rats subjected to DAI (HE,×400)

A：假手術組海馬；B：假手術組皮層；C：DAI后24 h海馬；D：DAI后24 h皮層。

2.2 大鼠神經行為學評分 DAI模型組在建模后均出現(xiàn)不同程度的昏迷，持續(xù)時間1～30 min不等，之后表現(xiàn)出不同程度的運動、感覺、平衡、反射等方面的神經功能缺損。DAI組均有明顯神經功能缺損，mNSS評分顯示大鼠建模后1 d神經功能缺損最為嚴重，3～7 d逐漸好轉。各組數據方差分析顯示各時間點組間差異具有統(tǒng)計學意義(F=52.88，P=0.005，表1)。

表1 各組大鼠mNSS神經功能評分的比較

Tab.1 The neurological scores of rats in different groups

組別例數1d評分3d評分7d評分假手術組60.00±0.000.00±0.000.00±0.00DAI組66.17±1.33*5.33±1.03*4.17±0.75*

與假手術組比較，*P<0.05。

2.3 DAI后大鼠海馬區(qū)caveolin-1的動態(tài)表達 DAI組各時間點海馬caveolin-1蛋白的表達均低于正常和假手術組(P<0.05)，并且傷后隨著時間的延長，caveolin-1蛋白的表達逐漸減少，方差分析顯示caveolin-1表達在各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=90.21,P=0.001，圖2)。

圖2 DAI后不同時間點caveolin-1的表達及灰度分析

Fig.2 The expression and gray value of caveolin-1 in rats after DAI

DAI組與正常組、假手術組比較，*P<0.05；每組n=6。

2.4 DAI后大鼠海馬區(qū)GFAP的表達 正常組及假手術組的海馬區(qū)均有少量GFAP表達。傷后1 d星形膠質細胞星狀突起纖細，GFAP分布于胞質及星狀突起中；傷后3 d GFAP增生活躍，星形膠質細胞外形肥大，突起粗大不規(guī)則；7 d后GFAP增生較前減少，外形仍肥大。DAI組海馬GFAP蛋白的表達均高于正常和假手術組(P<0.05)，DAI后3 d GFAP的表達較1 d明顯升高(P<0.05)，到了傷后7 d，GFAP的表達較3 d降低，但仍比1 d組、正常組及假手術組高(P<0.05)。方差分析顯示GFAP表達在各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=313.91,P=0.000，圖3)。

圖3 DAI后腦組織中GFAP的表達Fig.3TheexpressionofGFAPinthehippocampusofratsafterDAI(ICH,×200)A:正常組;B:假手術組;C～E:DAI后1、3、7d組。DAI組與正常組、假手術組比較,*P<0.05;每組n=6。

2.5 DAI后大鼠海馬區(qū)caveolin-1與GFAP的免疫熒光顯色及二者的共定位分析 在假手術組大鼠的海馬區(qū)，caveolin-1表達豐富，GFAP的表達較少。DAI后，海馬區(qū)的caveolin-1較正常減少，GFAP較正常增加，caveolin-1與GFAP出現(xiàn)共定位的細胞數量隨著時間的延長逐漸增加，7 d最多(圖4)。

3 討 論

DAI后胼胝體、白質、內囊及丘腦等處的神經元軸突存在腫脹等病理改變，受損傷的軸突分散在正常的軸突之間，為闡明DAI的病理機制，人們制作了各種動物模型，期望能模擬DAI的病理過程[9-10]。目前，關于DAI的模型主要有橫斷損傷模型、打擊負荷模型、液壓損傷模型、加速/減速損傷模型、牽拉損傷模型、瞬間旋轉損傷模型等[11]。本實驗采用的是大鼠頭顱瞬間旋轉損傷模型，是DAI研究中應用最廣泛、代表性最強的模型。該模型能使腦內產生剪應力，比其他模型更符合DAI的發(fā)生機制。本實驗通過HE染色對傷后1 d大鼠的皮層及海馬形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：DAI后神經元腫脹，核固縮，深染的固縮神經元數目明顯增多，神經細胞周圍出現(xiàn)空隙；并且大鼠mNSS評分在傷后1 d最高，隨后降低。結合組織學和神經行為學評分，本模型能很好的模擬DAI后的病理改變[12]。

腦外傷后星形膠質細胞的形態(tài)、蛋白的表達和細胞因子的釋放均發(fā)生變化，這種以增殖、細胞體和核過度腫大為特征，持續(xù)存在于任何受損部位的特異性病理過程稱為星形膠質細胞活化。GFAP是星形膠質細胞的特異性標志蛋白，廣泛的生理生化損傷和嚴重的病理刺激均可使星形膠質細胞合成GFAP，這種神經膠質合成活躍的過程是星形膠質細胞對腦內任何嚴重損害的一種特有反應[13]。在活性膠質細胞的發(fā)展中，GFAP的表達增加，最后成為膠質疤痕的主要成分[14-15]。NEARY等[16]對多種顱腦損傷進行觀察后發(fā)現(xiàn)，傷后早期GFAP分布于胞質及星狀突起中，星形膠質細胞的星狀突起纖細，傷后2 d GFAP星形膠質細胞增生活躍，數量增多，外形肥大，突起粗大；2 d 后星形膠質細胞數量明顯增多，胞體變大，突起粗大不規(guī)則，GFAP染色進一步加深。本實驗的結果顯示正常及假手術組的海馬區(qū)均有少量GFAP的表達，DAI后1 d，GFAP表達升高，3 d更高，7 d后降低，與既往研究結果相同[17]。

Caveolae是細胞質膜上存在的一些小凹點、小囊泡，屬于亞顯微結構，直徑約50～100 nm，富含神經綠色熒光代表caveolin-1，紅色熒光代表GFAP，二者merge后重疊部分為黃色(白色箭頭所示)；每組n=6。

圖4 大鼠彌漫性軸索損傷后不同時間點caveolin-1和GFAP的免疫熒光雙標染色

Fig.4 The expression and co-localization of caveolin-1 and GFAP in rats after DAI were evaluated by immunofluorescence staining at different time points (×200)

鞘磷脂、鞘糖脂、膽固醇以及各種蛋白質分子。Caveolae參與胞吞和胞內外運輸，細胞的分化、增殖、死亡和遷移，重塑細胞外環(huán)境，細胞的信號轉導等多種病理生理過程[4,18-19]。Caveolin-1是caveolae的標志蛋白，也是信號轉導的主要調節(jié)者，它可通過其腳手架域與信號分子直接接觸作用，調節(jié)它們的功能狀態(tài)，如eNOS，而對一些信號蛋白則與其受體結合來調節(jié)信號轉導[5]。在不同的病理生理過程中，caveolin-1呈現(xiàn)出不同的改變，既有caveolin-1的增加或減少，也有的caveolae形態(tài)改變[20]。本研究觀察了大鼠DAI后海馬組織內caveolin-1的表達變化，結果顯示隨著受傷時間的延長，caveolin-1的表達逐漸降低。

Caveolin-1在不同疾病模型中均參與了星形膠質細胞活化。在局灶性腦缺血模型中，caveolin-1缺失的小鼠較野生型小鼠表現(xiàn)出更強的星形膠質細胞活化，這可能是其加重腦損傷的機制之一[21]。大鼠脊髓經γ射線照射后，caveolin-1與GFAP的表達均增加，且二者之間共定位程度也增加，表明活化的星形膠質細胞內caveolin-1的表達增加，提示caveolin-1可能參與了γ射線導致的星形膠質細胞活化[22]。腦外傷后，辛伐他汀可以通過調控caveolin-1抑制GFAP的表達，也提示caveolin-1可能是GFAP的調控靶點之一[23]。本研究結果表明：DAI后大鼠海馬區(qū)caveolin-1的表達降低，其表達變化可能參與DAI后的病理生理過程。在正常海馬中，caveolin-1與GFAP幾乎不存在共定位，提示星形膠質細胞中caveolin-1的表達較少；DAI后，caveolin-1與GFAP的共定位程度明顯增加，提示GFAP陽性的星形膠質細胞內caveolin-1的表達增加，星形膠質細胞內GFAP與caveolin-1的表達呈正相關，增生的caveolin-1可能參與 GFAP及星形膠質細胞形態(tài)改變的調控。Caveolin-1參與GFAP表達及星形膠質細胞活化的具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，DAI可導致大鼠海馬區(qū)caveolin-1的表達降低，星形膠質細胞內caveolin-1的表達變化可能是導致GFAP升高及星形膠質細胞活化的機制之一。

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(編輯 韓維棟)

Changes of caveolin-1 expression in the hippocampus of rats afterdiffuse axonal injury and its relationship with activation of astroglia

ZHAO Yong-lin, SONG Jin-ning, MA Xu-dong, ZHANG Bin-fei,ZHANG Ming, LI Dan-dong, PANG Hong-gang, LUO Xian-hua

(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the dynamic expression of caveolin-1 in rat hippocampus after diffuse axonal injury (DAI) and its role in activation of astroglia. Methods Western blot was used to determine the expression of caveolin-1 in the hippocampus after DAI; immunohistochemistry staining was used to determine the dynamic expression of GFAP in the hippocampus of rats after DAI. The expression and co-localization of caveolin-1 and GFAP in rats after DAI were evaluated by immunofluorescence staining at different time points. Results The expression of caveolin-1 significantly decreased after DAI, and continued to decline from day 1 to day 7 (P<0.05). Immunohistochemistry staining indicated that GFAP-positive cells significantly increased from day 1 to day 3, and slightly decreased at day 7 (P<0.05). The co-localization of caveolin-1 and GFAP revealed that the number of both caveolin-1- and GFAP-positive cells gradually increased. Conclusion Caveolin-1 expression significantly decreased with the increase of GFAP expression in the hippocampus of rats after DAI. Caveolin-1 may be involved in the dynamic expression of GFAP and play an important role in the activation of astroglia after DAI.

diffuse axonal injury; caveolin-1; activation of astroglia; hippocampus; rat

2014-04-21

2014-06-27

國家自然科學基金資助項目(No.30471774)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學基金資助項目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831) and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師. E-mail：jinnings@126.com

趙永林(1987-)，男(漢族)，博士研究生在讀. 研究方向：腦血管病、腦外傷基礎及臨床. E-mail: zhaoyonglinlin@163.com

時間：2014-09-19 09∶27 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140919.0927.002.html

R651.1

A

10.7652/jdyxb201406005