劉 偉， 路 丹， 紀翠寧， 王 雪， 張林霞， 王光耀， 李秀國

(延邊大學醫(yī)學院，吉林 延吉 133002)

監(jiān)測蟾蜍動態(tài)心電的簡便有效方法*

劉 偉， 路 丹， 紀翠寧， 王 雪， 張林霞， 王光耀， 李秀國△

(延邊大學醫(yī)學院，吉林 延吉 133002)

目的： 篩選出適于監(jiān)測無束縛蟾蜍動態(tài)心電的導聯(lián)方式，并分析其實用性。方法: 蟾蜍在麻醉狀態(tài)下皮下包埋引導電極后，通過BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)監(jiān)測了5種導聯(lián)的動態(tài)心電，比較并篩選出能夠較好地顯示心電波形的導聯(lián)。利用該導聯(lián)監(jiān)測了蟾蜍從人工冬眠中復蘇6 h內的動態(tài)心電和連續(xù)5 d內的心率和心率變異性(heart rate variability, HRV)的日間穩(wěn)定性，以及凍融處理前后的心率和HRV，以分析其實用性。結果: 5種備選導聯(lián)中有2種導聯(lián)能較好顯示心電波形。與人工冬眠復蘇6 h比較，復蘇1 h之內的心率降低，竇性心率RR間期標準差(the standard deviation of normal R-R intervals, SDNN)升高，二者均有顯著差異(P<0.05或P<0.01)；2 h到5 h之間的心率和SDNN無顯著變化，提示心電在復蘇2 h后恢復穩(wěn)定。冬眠第4天和第5天的2 h和4 h心率較第1天顯著減慢(P<0.05或P<0.01)，而SDNN 較第1天顯著升高(P<0.05或P<0.01)，提示留置電極的蟾蜍心電在3 d內不會有顯著變化。與冷凍前比較，解凍1 h和12 h的心率顯著加快(P<0.05)，SDNN顯著變小(P<0.05)，表明凍融后蟾蜍心功能下降。結論: 皮下植入電極的方法可有效監(jiān)測蟾蜍動態(tài)心電。

心電圖； 心率變異性； 無束縛蟾蜍

作為兩棲類動物，蟾蜍的很多生理特性與哺乳動物相似，而被作為實驗動物大量地應用于生理和藥理學科研和教學中。蟾蜍實驗條件簡單，價格低廉，更符合現代科學研究倡導的“3R”原則。李秀國等[1]通過比較不同濕度和溫度條件下的蟾蜍生理功能后，發(fā)現在人工冬眠條件下能夠延長蟾蜍存活時間(36 d以上)，并能較好地維持其正常生理功能，為實驗室長時間合理利用蟾蜍提供了依據。在醫(yī)學科研中利用大鼠、小鼠等實驗動物描記心電圖的方法較多見。監(jiān)測方式主要有麻醉后皮下插入針狀電極測定標準肢體導聯(lián)[2-3]，或腹腔包埋發(fā)射子后無線遙測心電[4]等。前者由于麻醉狀態(tài)，一定程度影響心臟功能，后者由于價格昂貴，一般實驗室開展較困難。利用蟾蜍觀察心電圖的方法應用也較廣泛?，F在多監(jiān)測毀腦毀髓后的蟾蜍心電[5]。該方法由于蟾蜍心臟失去神經支配，不能完全反映生理狀態(tài)下的心電變化。一些人用無束縛蟾蜍監(jiān)測心電，但由于電極直接插入四肢皮下，不利于蟾蜍活動，且電極易脫落，從而影響長時間心電監(jiān)測[6]。本課題擬在蟾蜍皮下結扎包埋電極后，通過觀察5種導聯(lián)心電圖，篩選出能夠適于描記各心電波形的導聯(lián)；用選定導聯(lián)觀察人工冬眠復蘇蟾蜍6 h內的心率和代表心率變異性(heart rate variation，HRV)的時域指標，5 min竇性心率RR間期標準差(the standard deviation of normal R-R intervals, SDNN)變化趨勢及其5 d內的穩(wěn)定性；比較蟾蜍在凍融前后的心率和HRV，以期探索能夠有效監(jiān)測無束縛蟾蜍動態(tài)心電的簡便有效方法。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

蟾蜍雌雄混用，體重50～70 g，延邊大學實驗動物科提供；BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)和心電圖導聯(lián)線(四川成都泰盟科技有限公司)；任氏液為標準配方。

2 實驗方法

2.1 制作皮下包埋心電圖導聯(lián)線 取長17 cm、直徑0.5 mm的銅絲，一端彎成小圓環(huán)。取0.7 cm長的8號不銹鋼注射針頭套到銅絲的圓環(huán)端，并鉗夾固定，作為引導電極。銅絲其它部分外包PE管，管口兩端用膠水密封，以防止液體進入。

2.2 篩選最佳心電圖導聯(lián) 蟾蜍洗凈，腹腔注射25% 氨基甲酸乙酯5 mL/kg麻醉，用0.05% 碘伏消毒手術區(qū)域，從背部骶髂關節(jié)上方開一小口，將5條導聯(lián)線分別從右耳后腺后，左、右胸骨外上方，劍突下偏左和骶髂關節(jié)下方偏左引入到開口處。電極側固定在相應插入口的皮下，結扎縫合插入口。調整導聯(lián)線在皮下的位置，避免凸出皮膚或壓迫內臟，并在背部出口處捆成一束，將出口結扎縫合。術后將蟾蜍放入盛有少量任氏液的500 mL燒杯中。當從麻醉狀態(tài)中蘇醒，能夠自由活動時，參照文獻中方法將蟾蜍置于人工冬眠環(huán)境(溫度、濕度分別為3～5 ℃、75%～85%)中[1]。24 h后，放回室溫下，置于屏蔽用銅網上，按表1連接5種導聯(lián)，通過BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)監(jiān)測并比較各導聯(lián)的動態(tài)心電。通過導聯(lián)1～3比較在類似標準肢體I、II、III導聯(lián)條件下的心電。通過導聯(lián)3～5，比較電極置于背部和腹部時，標準II導聯(lián)心電。在整個實驗過程中，儀器均接地，并保持實驗室內安靜。

表1 備選蟾蜍心電圖引導電極連接部位一覽表

2.3 人工冬眠復蘇對電極留置蟾蜍心電的影響 為了觀察人工冬眠復蘇對皮下留置電極蟾蜍心電的影響，隨機取6只蟾蜍，按表1的導聯(lián)4行電極留置術并按照上述方法冬眠后，監(jiān)測復蘇6 h內的動態(tài)心電圖，并參照文獻中方法計算0～6 h的心率和SDNN[7]。由于蟾蜍相對安靜，很少出現劇烈活動。對于短暫的活動，測定RR間期時，應避開心電圖中肌電干擾大的部分進行測定。

2.4 電極留置蟾蜍心電的日間穩(wěn)定性 為了觀察電極留置蟾蜍動態(tài)心電的日間穩(wěn)定性，隨機取蟾蜍6只，按表1的導聯(lián)4行皮下留置電極術后，連續(xù)5 d監(jiān)測蟾蜍復蘇4 h內心電，比較各監(jiān)測日間的復蘇2 h和4 h的心率和SDNN，以分析蟾蜍心功能的日間穩(wěn)定性。在整個過程中，除監(jiān)測心電時將蟾蜍放置在室溫中之外，其它時間均置于人工冬眠環(huán)境中。

2.5 凍融對蟾蜍心電的影響 為了觀察皮下留置電極蟾蜍的實用性，隨機取蟾蜍6只，按表1的導聯(lián)4皮下植入電極，測定凍融前心電。之后，將蟾蜍在-20 ℃冷凍30 min致冷休克，在38 ℃任氏液解凍約20 min，至蟾蜍蘇醒，肢體運動自如，眨眼反射正常時監(jiān)測蟾蜍動態(tài)心電。比較冷凍前和凍融1 h、12 h后蟾蜍心率和SDNN。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析,數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用配對資料的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各種心電圖導聯(lián)結果比較

1.1 類似標準肢體I、II、III導聯(lián)的蟾蜍心電圖 按表1中的導聯(lián)1～3方式連接后，測得的4種動態(tài)心電圖見圖1。從圖中可見，導聯(lián)1的QRS波群較小，且P波和T波不太明顯。導聯(lián)2和3所測得的心電圖波形基本相似。其中P波、QRS波群、T波均比較明顯，PR間期和QT間期均可見。T波與QRS波群主波方向相反。

Figure 1.ECGs recorded by attaching the electrodes as the limb lead I, II and III. Lead 1, 2 and 3 were connected as in Table 1.

圖1 類似標準肢體I、II、III導聯(lián)條件下的蟾蜍心電圖

1.2 背部導聯(lián)和腹部導聯(lián)時，標準II導聯(lián)蟾蜍心電圖 采用導聯(lián)3～5的連接方式，測得的類似標準肢體II導聯(lián)心電圖見圖2。3種心電圖波形方向相同，其中以導聯(lián)4，即右側耳后腺后處放置負極，劍突下偏左為正極時心電圖波形最明顯。因此，后面研究均在導聯(lián)4留置電極。

Figure 2.ECGs recorded by attaching the electrodes on ventral or dorsal position in toads. Lead 3, 4 and 5 were connected as in Table 1.

圖2 蟾蜍背部或腹部放置引導電極時的心電圖

2 人工冬眠復蘇對留置電極蟾蜍心電的影響

蟾蜍從人工冬眠狀態(tài)中復蘇6 h內的心率和SDNN變化趨勢見表2。與復蘇6 h的心率比較，復蘇0 h和1 h的心率顯著降低(P<0.01)，而2～5 h心率無顯著差異。與復蘇6 h的SDNN比較，復蘇0 h和1 h的SDNN顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而2～5 h的SDNN無顯著差異。提示人工冬眠復蘇2 h后，蟾蜍的心電恢復穩(wěn)定。

表2 人工冬眠復蘇蟾蜍心率和SDNN的變化趨勢

Table 2.Variation trends of HR and SDNN in the toads recovering from artificial hibernation (Mean±SD.n=6)

Time(h)HR(min-1)SDNN(ms)010.58±2.50**256.35±121.06**124.31±3.01**52.25±25.37*230.67±3.0627.77±8.79332.88±3.2724.39±10.12433.41±4.1823.01±5.59533.58±4.2924.12±5.67634.27±4.8926.18±9.25

TableP<0.05,**P<0.01vs6 h.

3 人工冬眠復蘇蟾蜍心率和SDNN的日間穩(wěn)定性

電極留置蟾蜍連續(xù)5 d人工冬眠復蘇時，2 h和4 h心率和HRV的日間穩(wěn)定性見表3。與第1天的2 h和4 h心率比較，第4天和5天的心率下降(P<0.05或P<0.01)，第2天和第3天無顯著變化。與第1天 2 h和4 h的 SDNN比較，除了第4天2 h的SDNN之外，第4天和5天的SDNN下降顯著(P<0.05或P<0.01)，第2天和第3天的SDNN無顯著變化。提示人工冬眠復蘇蟾蜍的心電在前3 d無統(tǒng)計學變化。

表3 人工冬眠復蘇蟾蜍的心率和SDNN的日間穩(wěn)定性

Table 3.The day-to-day stability of HR and SDNN in toads recovering from the artificial hibernation (Mean±SD.n=6)

Time(d)2h4hHR(min-1)SDNN(ms)HR(min-1)SDNN(ms)134.90±6.4337.75±10.8639.84±5.8529.22±9.18232.39±4.9040.81±13.9137.85±3.9936.73±10.17333.52±5.0549.36±26.7636.04±3.8840.50±17.63428.85±3.74*55.49±29.6832.13±4.06*50.53±20.77*530.11±4.26*62.82±27.58*33.22±5.69**55.19±27.35**

TableP<0.05,**P<0.01vs1 d.

4 凍融對蟾蜍心率和SDNN的影響

監(jiān)測凍融前后蟾蜍心率和SDNN結果見表4。解凍1 h心率較冷凍前顯著加快(P<0.01)，SDNN顯著變小(P<0.05)；解凍12 h心率較冷凍前也顯著加快(P<0.05)，SDNN也顯著變小(P<0.05)；解凍1 h和12 h的心率和SDNN均無顯著差異。表明凍融后蟾蜍心功能明顯受損。

表4 凍融對蟾蜍心率和SDNN的影響

Table 4.Effects of freeze-thawing process on HR and HRV in toads (Mean±SD.n=6)

ParameterPre-freezePost-thawing1h12hHR(min-1)19.38±5.0632.29±4.47**28.22±5.76*SDNN(ms)177.72±103.5348.43±10.38*68.45±23.42*

TableP<0.05,**P<0.01vspre-freeze.

討 論

本實驗通過在皮下留置引導電極后，監(jiān)測了5種導聯(lián)方式的蟾蜍動態(tài)心電。結果發(fā)現，以類似標準II或III導聯(lián)方式測得的心電圖波形較類似標準I導聯(lián)明顯。進一步以類似標準II導聯(lián)模式在腹側面和背側面連接心電圖導聯(lián)的負極后發(fā)現，3種心電圖波形相似。因為在背側面留置導聯(lián)線較在腹側面容易，且對機體損傷小，根據本實驗結果，建議右耳后腺后留置負極。將正極連接到劍突下和骶髂關節(jié)處時的心電圖各波波形均清晰，且以前者的心電圖波形幅度更大。這一結果應該與生理狀態(tài)下蟾蜍心尖偏向腹側面，導致心電軸偏向腹側面有關。在心電監(jiān)測過程中，引導電極有可能會因為蟾蜍的活動發(fā)生移位，從而對監(jiān)測產生一定影響。通過實驗發(fā)現，如果留置3根導聯(lián)線，其中負極固定在右側耳后腺后，正極固定在劍突下和骶髂關節(jié)位置，形成3點支撐，可以明顯減少電極移動，并可同時監(jiān)測2個導聯(lián)的心電，有效防止心電圖波形變形對測定結果的影響。

在健康狀態(tài)下，許多生理系統(tǒng)存在自然易變性。心率在正常情況下也是呈不規(guī)則性變化的。HRV是評價心血管和植物神經調節(jié)功能，以及生理和心理健康程度可信賴的多功能指標[6]。HRV是通過24 h或更長時程的動態(tài)心電資料的一段時間數據獲得的。其中最簡單可行的時域指標是連續(xù)24 h正常SDNN，用來描述RR間期的分散特征。然而，數分鐘甚至10 s的短時程心電記錄獲得的HRV具有同等價值[7]。本實驗通過測定連續(xù)5 min的SDNN比較了不同處理因素對蟾蜍HRV的影響。

根據李秀國等[1]的研究，人工冬眠能夠延長蟾蜍在實驗室存放時間。為了監(jiān)測蟾蜍從冬眠狀態(tài)中移到室溫時蟾蜍心電變化趨勢和在室溫中保持相對穩(wěn)定的心電所需時間，本實驗將電極留置蟾蜍從人工冬眠中移到室溫后，監(jiān)測了其6 h動態(tài)心電。結果發(fā)現，冬眠蟾蜍心率和SDNN在復蘇2 h后能夠處于穩(wěn)定狀態(tài)。皮下留置電極手術會對蟾蜍機體造成一定損傷，進而影響機體生理功能。為了觀察電極留置術后蟾蜍經人工冬眠后能夠維持相對穩(wěn)定的心電的時間，監(jiān)測了其連續(xù)5 d冬眠處理后的動態(tài)心電。結果發(fā)現，皮下電極留置蟾蜍的心電在冬眠前3 d之內心率和SDNN無顯著變化。

心肌損傷、心功能衰竭可表現為心電異常，心率和HRV的變化[7]。本實驗中利用皮下留置電極蟾蜍監(jiān)測了凍融對蟾蜍心率和SDNN的影響。結果顯示，凍融能夠使蟾蜍的心率顯著加快，SDNN顯著變小，能夠證實凍融可導致蟾蜍心功能下降。

通過本實驗發(fā)現，蟾蜍一般比較安靜，適于在皮下留置引導電極后長時間觀察動態(tài)心電。與毀腦毀髓后測得的心電比較，這種方式更能夠反映接近生理狀態(tài)的心電。由于本實驗方法能夠用簡單的設備和材料監(jiān)測無束縛蟾蜍心電活動，具有簡單、有效且經濟等優(yōu)點，對于心臟生理和藥理學方面研究可能有較好的應用前景。

[1] 李秀國, 李鴻雁, 李海東, 等. 溫度和濕度對蟾蜍生理功能的影響[J]. 四川動物, 2013, 32(5):734-738.

[2] Esmailidehaj M, Mirhosseini SJ, Rezvani ME, et al. Prolonged oral administration of oleuropein might protect heart against aconitine-induced arrhythmia [J]. Iran J Pharm Res, 2012, 11(4):1255-1263.

[3] 張引國, 魏 潔. 低體溫與心率變異性和血壓變異性的關系[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(10):1906-1908.

[4] 王福文, 趙敬國, 王純雨, 等. 反復力竭性運動后不同時相大鼠心電圖的動態(tài)改變[J]. 中國康復醫(yī)學雜志, 2010, 25(11):1030-1034.

[5] 李秀國, 張民鋒, 樸日龍, 等. 同步監(jiān)測蟾蜍心臟機械和電活動簡便而有效的方法[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(2):375-379.

[6] Chapovetsky V, Katz U. Effects of season and temperature acclimation on electrocardiogram and heart rate of toads [J]. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2003, 134(1):77-83.

[7] Sch?fer A, Vagedes J. How accurate is pulse rate variabi-lity as an estimate of heart rate variability? A review on studies comparing photoplethysmographic technology with an electrocardiogram [J]. Int J Cardiol, 2013, 166(1):15-29.

Simple and effective method for monitoring ambulatory electrocardiogram in toads

LIU Wei, LU Dan, JI Cui-ning, WANG Xue, ZHANG Lin-xia, WANG Guang-yao, LI Xiu-guo

(CollegeofBasicMedicine,YanbianUniversity,Yanji133002,China.E-mail:lixg@ybu.edu.cn)

AIM: To screen out a suitable lead for monitoring the ambulatory electrocardiogram (ECG) in unrestrained toad, and to investigate its practicability. METHODS: After subcutaneously implanting the electrodes in toads under anaesthesia, the ambulatory ECG of 5 leads were monitored with BL-420S data acquisition and analysis system, and the leads which could well express the waveform in ECG were screened out. The recovery process of the toads from the artificial hibernation within 6 h, the day-to-day stability of the heart rate (HR) and the heart rate variability (HRV) in 5 successive days of hibernation, and the HR and HRV after freeze-thawing process were monitored to determine its practicability. RESULTS: Two out of 5 leads showed better ECG waveforms. Compared with 6 h post hibernation, lowered HR at 0 h and 1 h was observed, and the standard deviation of normal R-R intervals (SDNN) was significantly increased (P<0.05 orP<0.01), but the HR and SDNN from 2 to 5 h showed no significant difference, suggesting that the cardiac function reached the steady state after 2 h recovery. The HR at 2 h and 4 h on day 4 and day 5 decreased significantly compared with that on day 1 (P<0.05 orP<0.01), followed with a significant increase in SDNN (P<0.05 orP<0.01), suggesting that the ECG remained stable within 3 d. The HR increased, while SDNN decreased significantly at 1 h and 12 h post-thawing compared with that at pre-freeze (P<0.05), indicating the damaged cardiac function after freeze-thawing process. CONCLUSION: The method of subcutaneously implanting electrodes is suitable for effectively monitoring the ambulatory ECG in toads.

Electrocardiogram; Heart rate variability; Unrestrained toad

1000- 4718(2014)12- 2300- 05

2014- 06- 24

2014- 07- 24

國家教育部留學回國項目(教外司留609號)；延邊大學第六屆本科生科研立項基金項目

R33-33； R331.3+8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.034

△通訊作者 Tel: 0433-2435165; E-mail: lixg@ybu.edu.cn