王先紅， 田苗苗， 潘晴晴， 魯亞楠， 王 玉

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

·短篇論著·

丘腦前核在三叉神經(jīng)電刺激減輕癲癇發(fā)作和海馬神經(jīng)元損傷中的作用*

王先紅， 田苗苗， 潘晴晴， 魯亞楠， 王 玉△

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

目的： 探討丘腦前核在三叉神經(jīng)電刺激(TNS)減輕癲癇發(fā)作和海馬神經(jīng)元損傷中的作用。方法：大鼠經(jīng)腹腔注射匹羅卡品建立慢性癲癇模型，模型大鼠分別給予假刺激、三叉神經(jīng)電刺激和立體定向毀損丘腦前核預(yù)處理后三叉神經(jīng)電刺激1月，再次誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，觀察大鼠的癲癇行為表現(xiàn)，并通過(guò)TUNEL、Fluoro-Jade B (FJB)染色和Nissl染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡、變性及脫失情況。結(jié)果：與未經(jīng)毀損丘腦前核的TNS處理大鼠相比，毀損丘腦前核后的TNS處理大鼠癲癇發(fā)作的級(jí)別分?jǐn)?shù)及持續(xù)時(shí)間明顯增加(P<0.05)，且毀損丘腦前核后的TNS處理大鼠癲癇發(fā)作后海馬CA1區(qū)TUNEL、FJB陽(yáng)性細(xì)胞及細(xì)胞的脫失較TNS組顯著增加(P<0.01)。結(jié)論：毀損丘腦前核后，TNS減輕癲癇發(fā)作及海馬神經(jīng)元損傷的作用被顯著降低，表明丘腦前核在TNS抗癲癇中發(fā)揮一定的作用；潛在機(jī)制可能是TNS通過(guò)丘腦前核慢性激活丘腦與大腦皮層的纖維聯(lián)系，使海馬神經(jīng)元興奮性易感性改變。

癲癇； 三叉神經(jīng)電刺激； 神經(jīng)保護(hù)作用； 立體定向毀損； 丘腦前核

癲癇是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約為0.6%，盡管新一代抗癲癇藥及先進(jìn)外科手術(shù)的采用使大部分的癲癇患者的病情得到控制，仍有約30%的患者轉(zhuǎn)化為難治性癲癇[1]。最近的研究報(bào)道，三叉神經(jīng)電刺激(trigeminal nerve electrostimulation，TNS)可能為難治性癲癇患者帶來(lái)新的治療效果，初步的臨床及實(shí)驗(yàn)研究成果表明它有抗癲癇作用[2-4]。我們前期的研究也進(jìn)一步證實(shí)了這一作用[5]，并發(fā)現(xiàn)其潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[6]及減輕海馬炎癥反應(yīng)的作用[7]。目前尚未有關(guān)于TNS抗癲癇作用的神經(jīng)傳導(dǎo)機(jī)制的研究報(bào)道。有大量的研究表明丘腦前核(anterior thalamic nucleus, ATN)的電活動(dòng)參與癲癇放電的調(diào)節(jié)，因此丘腦前核也成了腦深部電刺激(deep brain stimulation，DBS)的重要靶向部位[8]。三叉神經(jīng)感覺傳導(dǎo)與丘腦前核之間有著密切的解剖聯(lián)系，因此我們推測(cè)TNS抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)作用可能與丘腦前核相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在慢性癲癇模型基礎(chǔ)上予以人為誘發(fā)一次癲癇發(fā)作[9-10]，并通過(guò)立體定向毀損丘腦前核核團(tuán)觀察丘腦前核在TNS抗癲癇中的作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和設(shè)備

雄性SD大鼠95只，體重180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于安靜、避光的環(huán)境中，給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料及水。

匹羅卡品(pilocarpine, Pilo)及東莨菪堿購(gòu)于Sigma；鵝膏蕈氨酸(ibotenic acid)購(gòu)于Tocris；尼氏染液購(gòu)于碧云天；TUNEL試劑盒購(gòu)于南京凱基；Fluoro-Jade B (FJB)購(gòu)于Millipore。經(jīng)皮電刺激儀(KD-2A型)購(gòu)于北京博洋生物器械有限公司；立體定向毀損儀購(gòu)于深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物癲癇模型的制作 95只健康雄性SD大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，其中正常對(duì)照組20只，實(shí)驗(yàn)組75只。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg以拮抗外周膽堿反應(yīng)，30 min后，腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品380 mg/kg，每30 min追加30 mg/kg，達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)。15 min后觀察大鼠行為，癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度參照Racine Ⅴ級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[9]：Ⅰ級(jí)：出現(xiàn)面部抽搐，鼻毛抽動(dòng)，前爪抓耳及咀嚼動(dòng)作；Ⅱ級(jí)：出現(xiàn)點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，一側(cè)前肢陣攣；Ⅲ級(jí)：出現(xiàn)肢陣攣和輕微的身體抽搐；Ⅳ級(jí)：肢體陣攣，甩尾，牙關(guān)緊閉，全身抽搐；Ⅴ級(jí)：全身陣攣，失去平衡跌倒并全身僵直。Ⅲ級(jí)或Ⅲ級(jí)以上行為重復(fù)出現(xiàn)者界定為癲癇發(fā)作。癲癇發(fā)作后30 min，腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止發(fā)作。應(yīng)用視頻監(jiān)視大鼠1個(gè)月，觀察其自發(fā)性癲癇發(fā)作情況，確定具有自發(fā)反復(fù)性發(fā)作的慢性癲癇大鼠。實(shí)驗(yàn)組慢性癲癇大鼠隨機(jī)分為Pilo組(n=25)、TNS組(n=25)和ATN組(n=25)，實(shí)驗(yàn)中有6只大鼠死亡則予以相應(yīng)的處理后增補(bǔ)。

2.2 立體定向核團(tuán)毀損 慢性癲癇大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)進(jìn)行術(shù)前麻醉，固定于立體定向毀損儀，用牙鉆分別在顱骨上打洞，根據(jù)Pa-xinos and Watson 大鼠腦立體定向圖譜，兩側(cè)丘腦前核坐標(biāo)為AP：-1.5 mm； L：1.0 mm或-1.0 mm； DV：6.0 mm[11-12]，ATN組立體定向微量注射10 μL/kg鵝膏蕈氨酸磷酸鹽緩沖液0.25 μL[13-14]，TNS組和Pilo組則立體定向注射磷酸鹽緩沖液0.25 μL。緩慢勻速注射后留針5 min，緩慢拔出。術(shù)后大鼠腹腔注射青霉素抗感染，自由獲取食水，待1周左右恢復(fù)。

2.3 三叉神經(jīng)電刺激 大鼠恢復(fù)后，分別對(duì)ATN組和TNS組大鼠進(jìn)行TNS 1個(gè)月。操作前大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉動(dòng)物 ,大鼠俯臥固定，將2個(gè)模式電極對(duì)稱外置于眼眶上方約1 cm中內(nèi)1/3處的三叉神經(jīng)眼支分布區(qū)域，固定后外接經(jīng)皮神經(jīng)電刺激儀。刺激參數(shù)：頻率140 Hz、電流10 mA、脈寬0.5 ms、正向脈沖刺激1 min間歇4 min，每天連續(xù)刺激60 min[5]。Pilo組大鼠固定后，外接電刺激儀，刺激參數(shù)均設(shè)置為0，持續(xù)60 min。各組操作均在8：00～12：00間進(jìn)行。

2.4 動(dòng)物取材 慢性癲癇模型再次腹腔注射匹羅卡品(350 mg/kg)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，分別用于癲癇行為觀察和海馬神經(jīng)細(xì)胞受損及死亡的觀察。癲癇發(fā)作后30 min腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止發(fā)作，于24 h、48 h、72 h、1周各時(shí)點(diǎn)每組各取5只大鼠斷頭取腦觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞受損及死亡情況；用于癲癇行為觀察的大鼠(實(shí)驗(yàn)組每組各5只)則不予以地西泮終止發(fā)作。大鼠腹腔麻醉后固定，開胸暴露心臟，將針插入左心室心尖部，剪右心耳，0.9%氯化鈉注射液100 mL快速灌注以沖凈血液，再用4%多聚甲醛100 mL先快后慢灌注固定全身后斷頭取腦。根據(jù)Paxinos and Watson 大鼠腦立體定向圖譜，分別取含有海馬結(jié)構(gòu)，含有丘腦前核的2～3 mm厚腦塊(冠狀切面)固定于多聚甲醛中，流水沖洗過(guò)夜后常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，海馬切片厚4 μm；丘腦前核冠狀面連續(xù)切片4 μm，Nissl染色觀察丘腦前核毀損部位。

2.5 Nissl染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加尼氏染液(有效成分焦油紫)置于37 ℃溫箱中反應(yīng)20 min，蒸餾水沖洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.6 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，按照試劑盒說(shuō)明書行TUNEL染色。 染色后凋亡細(xì)胞呈棕黃色至黃色，陰性細(xì)胞核藍(lán)色。并做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，陰性對(duì)照滴加PBS，代替TdT酶反應(yīng)液，應(yīng)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；陽(yáng)性對(duì)照在TdT酶反應(yīng)液前滴加DNase I處理切片，應(yīng)全為陽(yáng)性細(xì)胞。

2.7 FJB染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，浸入1% NaOH和80%乙醇混合液5 min，蒸餾水中2 min，再浸入0.06%高錳酸鉀溶液20 min(室溫，搖床)后蒸餾水漂洗2 min，再浸入0.0004%的FJB染液中避光反應(yīng)30 min后蒸餾水漂洗3 min，自然晾干、二甲苯透明后，中性樹膠封片。在熒光顯微鏡下采用藍(lán)色濾色片(激發(fā)光波長(zhǎng)為450～490 nm)觀察并采集圖像。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)解剖學(xué)定位，每只大鼠取5張非連續(xù)的一側(cè)海馬切片進(jìn)行分析，并保證這些腦片的斷面水平

在各鼠均相似。400倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野觀察大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL、FJB、Nissl陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丘腦前核毀損結(jié)果

ATN組可見大鼠丘腦前核核團(tuán)細(xì)胞形態(tài)紊亂，結(jié)構(gòu)消失，符合化學(xué)毀損的特點(diǎn)，見圖1。

Figure 1.Nissl-stained sections of anterior thalamic nucleus (ATN) region of ATN group. The arrows in figure A mean ATN regions of figure B and C.

圖1 ATN組大鼠丘腦前核的Nissl染色結(jié)果

2 各組大鼠癲癇發(fā)作的比較

正常對(duì)照(control)組大鼠無(wú)癲癇發(fā)作。實(shí)驗(yàn)組大鼠再次誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，TNS組大鼠癲癇發(fā)作等級(jí)分?jǐn)?shù)、持續(xù)時(shí)間均較Pilo組有明顯減少，而ATN組大鼠發(fā)作等級(jí)分?jǐn)?shù)、持續(xù)時(shí)間均較TNS組明顯增多，見表1。

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作等級(jí)分?jǐn)?shù)和持續(xù)時(shí)間的比較

Table 1.Severity and duration of seizures among Pilo group, TNS group and ATN group (Mean±SD.n=5)

GroupSeizurescoreSeizureduration(min)Pilo3.13±0.7223.63±3.24TNS1.88±0.96*10.63±3.68*ATN2.75±0.68#14.56±2.56#

TableP<0.05vsPilo group;#P<0.05vsTNS group.

3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL的表達(dá)

正常對(duì)照組未見TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，大鼠海馬CA1區(qū)見藍(lán)染的錐體細(xì)胞，排列緊密，細(xì)胞核完整；Pilo組各時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)可見TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，錐體細(xì)胞凋亡，胞核固縮呈圓形或不規(guī)則形，核棕黃色或黃色，72 h達(dá)到高峰，1周后略有下降；TNS組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較Pilo組明顯減少；72 h ATN組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較TNS組明顯增多，見圖2、3。

4 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元FJB 染色結(jié)果

正常對(duì)照組未見FJB陽(yáng)性細(xì)胞；Pilo組各時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)可見FJB陽(yáng)性細(xì)胞，錐體細(xì)胞排列紊亂，胞體和部分突起呈亮黃綠色，72 h達(dá)到高峰，1周略有下降；TNS組FJB陽(yáng)性細(xì)胞較Pilo組明顯減少；72 h ATN組FJB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較TNS組明顯增多，見圖4、5。

Figure 2.The expression of TUNEL(+) cells 72 h after seizures. A: control group; B: Pilo group; C: TNS group; D:ATN group.

圖2 各組大鼠癲癇發(fā)作后72 h 海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)

Figure 3.Comparison of the number of TUNEL (+) cells in hippocampal CA1 area at different time points among Pilo group, TNS group and ATN group. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsPilo group；#P<0.05vsTNS group.

圖3 不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較

5 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Nissl染色結(jié)果

正常對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)見大量錐體細(xì)胞，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完整，胞漿內(nèi)含有豐富的尼氏小體；再次誘導(dǎo)癲癇發(fā)作72 h后Pilo組錐體細(xì)胞大量脫失，排列紊亂，細(xì)胞腫脹變形，胞漿內(nèi)尼氏小體減少；TNS組存活的神經(jīng)元較Pilo組明顯增多；ATN組則較TNS組明顯減少，見圖6。Control組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目為84.0±4.0，Pilo組為27.0±1.6，TNS組為62.2±6.1，ATN組為41.2±6.8；Pilo組與TNS組比較、ATN組與TNS組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)中，TNS治療組大鼠的癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度及持續(xù)時(shí)間較Pilo組明顯下降，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡、變性及脫失較Pilo組明顯減輕。結(jié)果顯示三叉神經(jīng)慢性電刺激有抗癲癇作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)癲癇發(fā)作所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

Figure 4.FJB-stained sections of hippocampal CA1 region 72 h after seizures. A: control group; B: Pilo group;C: TNS group; D: ATN group.

圖4 各組大鼠癲癇發(fā)作后72 h 海馬CA1區(qū)FJB的染色結(jié)果

Figure 5.Comparison of the number of FJB(+) cells in hip-pocampal CA1 area at different time points among Pilo group, TNS group and ATN group. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsPilo group;#P<0.05vsTNS group.

圖5 不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)FJB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較

關(guān)于三叉神經(jīng)電刺激的抗癲癇作用及其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚未見有研究報(bào)道?；谌嫔窠?jīng)的解剖結(jié)構(gòu)，三叉神經(jīng)將頭面部感覺信息傳入至三叉神經(jīng)感覺核，并將觸覺、痛覺信息傳入丘腦，還有一部分則傳入至臨近腦干的孤束核、藍(lán)斑核。迷走神經(jīng)電刺激的抗癲癇機(jī)制目前認(rèn)為系通過(guò)激活孤束核和藍(lán)斑核，而使大腦產(chǎn)生去同步化作用[15]，因此有推測(cè)認(rèn)為三叉神經(jīng)的抗癲癇作用可能通過(guò)孤束核和藍(lán)斑核發(fā)揮作用[16]。而本實(shí)驗(yàn)是在慢性癲癇模型中三叉神經(jīng)慢性電刺激后觀察的臨床發(fā)作和腦損傷結(jié)果，因此不能用電刺激所致即刻的腦電去同步化來(lái)解釋。本實(shí)驗(yàn)最重要的發(fā)現(xiàn)是部分毀損丘腦前核則降低了三叉神經(jīng)慢性電刺激對(duì)癲癇發(fā)作的抑制作用及減輕腦損傷的保護(hù)作用，提示三叉神經(jīng)慢性電刺激的抗癲癇作用至少與通過(guò)丘腦前核的沖動(dòng)傳導(dǎo)有關(guān)。近年來(lái)，已有大量的動(dòng)物和臨床研究表明丘腦前核電刺激具有抗癲癇作用[17-18]。這與我們的研究結(jié)果相一致，即TNS通過(guò)激活丘腦前核從而起到抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)作用。

Figure 6.Nissl-stained sections of hippocampal CA1 region 72 h after seizures. A: control group; B: Pilo group; C: TNS group; D: ATN group.

圖6 各組大鼠癲癇發(fā)作后72 h 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Nissl染色結(jié)果

丘腦前核與大腦皮層聯(lián)系廣泛。有研究報(bào)道，丘腦前核電刺激通過(guò)丘腦前核與大腦皮層的纖維聯(lián)系使大腦扣帶回、島葉、頂葉后部皮層和顳葉皮層等區(qū)域皮層神經(jīng)細(xì)胞得到激活[8, 19]。較低強(qiáng)度的丘腦前核電刺激對(duì)癲癇發(fā)作起抑制作用，而較強(qiáng)的丘腦前核電刺激則對(duì)癲癇發(fā)作起促進(jìn)作用[20]，表明通過(guò)丘腦前核的電刺激進(jìn)行慢性驚厥閾值下的皮層激活可改變皮層的興奮性易感性，即提高了癲癇發(fā)作閾值，從而減少自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作。因此我們認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，三叉神?jīng)電刺激通過(guò)不斷激活丘腦前核皮層環(huán)路，導(dǎo)致皮層的慢性癲癇發(fā)作閾下性激活，從而降低了皮層的興奮性。這與既往報(bào)道的慢性阻斷谷氨酸受體可誘導(dǎo)自發(fā)性癇性放電的結(jié)果相一致[21-22]，同時(shí)也與文獻(xiàn)報(bào)道的丘腦前核毀損干擾到腦皮層突觸可塑性形成的結(jié)果相一致[23-24]。

綜上，丘腦前核在TNS抗癲癇中發(fā)揮一定的作用，其潛在的機(jī)制可能與TNS激活丘腦前核與大腦皮層的神經(jīng)環(huán)路有關(guān)。但丘腦前核與三叉神經(jīng)作用的確切機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。

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Role of anterior thalamic nucleus in trigeminal nerve electrostimulation-induced reduction of seizures and hippocampal damage

WANG Xian-hong, TIAN Miao-miao, PAN Qing-qing, LU Ya-nan, WANG Yu

(DepartmentofNeurology,TheFirstHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China.E-mail:yw4d@hotmail.com)

AIM: To investigate the role of anterior thalamic nucleus in trigeminal nerve electrostimulation (TNS)-induced effects on seizures and hippocampal damage. METHODS: The rats were intraperitoneally injected with pilocarpine to induce chronic epilepsy, and then

sham treatment, TNS treatment and TNS treatment after stereotactic lesion to the anterior thalamic nucleus. The TNS treatment lasted for 1 month in each group. Another injection of pilo-carpine was conducted to induce seizures, and the severity and duration of seizures were quantitatively evaluated. TUNEL, Fluoro-Jade B (FJB) and Nissl staining were applied to determineinsituapoptosis, neuronal degeneration and neuron loss in the hippocampal CA1 area respectively. RESULTS: Compared with TNS group, TNS treatment after stereotactic lesion to the anterior thalamic nucleus significantly increased the severity and duration of seizures (P<0.05), and the numbers of TUNEL positive cells, FJB positive cells and lost neurons in the hippocampal CA1 area (P<0.01). CONCLUSION: Anterior thalamic nucleus plays a role in TNS-induced reduction of seizures and hippocampal damage. The mechanisms might be due to the chronically activation of the cortex through anterior thalamic nucleus pathway induced by TNS, resulting in the down-regulation of neuronal excitatory susceptibility.

Epilepsy; Trigeminal nerve electrostimulation; Neuroprotection; Stereotactic lesion; Anterior thalamic nucleus

1000- 4718(2014)12- 2249- 06

2014- 07- 18

2014- 10- 13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No. 81271444)； 安徽省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No. 11010402168)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.023

△通訊作者 Tel: 0551-62922665; E-mail: yw4d@hotmail.com