董 珺， 曾波航， 劉寧寧， 莫 沛， 熊龍根,， 劉世明,， 黎 佼,△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1腫瘤科， 2心內(nèi)科， 3廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

MicroRNA-378*通過抑制CTGF促進人骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡*

董 珺1,3， 曾波航1， 劉寧寧3， 莫 沛2， 熊龍根2,3， 劉世明2,3， 黎 佼2,3△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1腫瘤科，2心內(nèi)科，3廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

目的： 研究年齡相關(guān)microRNA-378* (miR-378*) 對人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)存活和凋亡的調(diào)控作用。方法: 通過microRNA芯片和qRT-PCR檢測供體年齡對hMSCs 中miR-378*表達的影響；通過H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡；通過轉(zhuǎn)染miR-378*模擬物或抑制物，過表達或抑制miR-378*的表達；用MTT、LDH、caspase-3/7、TUNEL檢測等方法研究其對hMSCs存活和凋亡的影響；通過siRNA研究結(jié)締組織生長因子(CTGF)對hMSCs存活和凋亡的影響。結(jié)果: 隨供體年齡增加，hMSCs 中miR-378*的表達增加。H2O2刺激可促進miR-378*表達，抑制CTGF表達。過表達miR-378*可減少hMSCs的存活，促進細胞凋亡。相反，抑制miR-378*的表達促進hMSCs的存活，減少細胞凋亡。同時抑制miR-378*和CTGF的表達，使miR-378*失去對hMSCs存活和凋亡的調(diào)控作用。直接抑制CTGF的表達可減少hMSCs的存活，促進細胞凋亡。結(jié)論: miR-378*通過抑制CTGF的表達減少hMSCs存活，促進hMSCs凋亡。

人骨髓間充質(zhì)干細胞； MicroRNA-378*； 細胞凋亡

我們的前期研究證實，隨著供體年齡的增加，骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖、分化能力下降，細胞衰老增加，microRNA的表達發(fā)生改變[1-2]。而隨著人骨髓間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)供體年齡的增加，表達發(fā)生改變的microRNA，影響了hMSCs的功能，例如：隨供體年齡增加，表達下降最顯著的microRNA-10a (miR-10a)，可通過Krupple樣受體4(Krupple-like receptor 4，KLF4)再生hMSCs的分化能力，減少細胞衰老，抑制hMSCs增殖[2]；而隨著供體年齡的增加，表達升高最顯著的miR-196a，可通過同源框B7(homeobox B7,HOXB7)及堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)抑制hMSCs增殖[3]；最近的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-378可以通過抑制胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)促進大鼠心肌細胞凋亡[4]。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，隨著供體年齡的增加，miR-378家族中miR-378*的表達上調(diào)，hMSCs衰老增加[2]。基于miR-378*可能參與調(diào)控hMSCs的存活與凋亡，本研究探討了miR-378*對hMSCs存活及凋亡的調(diào)控作用，并進一步探討其分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人骨髓的提取 通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，與患者簽訂知情同意書后，在心臟瓣膜病患者手術(shù)過程中吸取人骨髓5 mL。供體為17～30歲者定義為年青組，65～80歲者定義為年老組，排除腫瘤、乙肝、HIV感染等因素。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清和OPTI-MEM 培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑和Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；LDH細胞毒性檢測試劑盒和MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天)；caspase-3/7活性檢測試劑盒(Promega)；原位細胞凋亡檢測試劑盒(Roche)；SYBR Green熒光定量試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo)；淋巴細胞分離液(MPBIO)；熒光定量PCR儀(ABI)；多功能酶標儀(TECAN)。

2 方法

2.1 hMSCs的提取及鑒定 將人骨髓小心疊加于等體積的淋巴細胞分離液上層，4 ℃下以2 000 r/min離心20 min，吸取分離液和血漿界面的云霧狀的單個核細胞層，用無血清IMDM懸浮后，以1 000 r/min離心。按2×109/m2密度接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48 h后換液，貼壁細胞每3 d換液，待細胞融合度達80%以上時，胰酶消化傳代，第3代細胞用于實驗研究并通過流式細胞儀檢測細胞表面特異性抗原的表達(CD29，CD31，CD34，CD44，CD45和CD166)[2]。

2.2 MicroRNA芯片檢測及qRT-PCR檢測 分別選取年青組(17歲、20歲、25歲)及年老組(78歲、80歲、75歲)hMSCs送于北京博奧生物有限公司進行mico-RNA芯片檢測。用1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過qRT-PCR檢測miR-378*及結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達，分別選取U6及GAPDH作為內(nèi)參照。各引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3 細胞轉(zhuǎn)染 miR-378*模擬物、抑制物和si-CTGF及其相應(yīng)的陰性對照均由上海吉瑪公司合成，具體序列見表2。hMSCs培養(yǎng)于 24 孔板，無血清培養(yǎng)過夜后，更換為新鮮無血清及抗生素培養(yǎng)基(500 μL/孔)。將小分子 RNA 稀釋于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，加入1 μL Lipofectamine RNAiMAX，輕柔混勻后室溫放置15 min；將 RNAiMAX與miRNA/siRNA的稀釋液加入 24 孔板的各孔細胞中，培養(yǎng)48 h按實驗需要處理細胞。miR-378*模擬物及陰性對照的終濃度為100 nmol/L；miR-378*抑制物及陰性對照的終濃度為200 nmol/L；siRNA及其對照的終濃度為20 nmol/L。

2.4 MTT檢測 H2O2(300 μmol/L，5 h)刺激不同預(yù)處理組 hMSCs后(詳見細胞轉(zhuǎn)染實驗方法)，通過MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測hMSCs活性(hMSCs以1×108/m2密度培養(yǎng))。

表2 MicroRNA與siRNA序列

2.5 LDH及caspase-3/7檢測 H2O2(300 μmol/L，5 h)刺激不同預(yù)處理組 hMSCs后，通過LDH細胞毒性檢測試劑盒及caspase-3/7活性檢測試劑盒，檢測不同預(yù)處理組中LDH酶及caspase-3/7的活性(hMSCs以3×108/m2密度培養(yǎng))。

2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 H2O2(300 μmol/L，5 h)刺激不同預(yù)處理組 hMSCs后，通過原位細胞凋亡檢測試劑盒檢測不同預(yù)處理組中細胞凋亡的表達(hMSCs以1.5×109/m2密度培養(yǎng))。DAPI復(fù)染細胞核，熒光顯微鏡下檢測細胞凋亡情況(每實驗組做3復(fù)孔，每孔隨機選取6個區(qū)域，行染色陽性細胞計數(shù))。

2.7 Western blotting檢測CTGF蛋白表達 各實驗組細胞處理完畢后，加入細胞裂解液，4 ℃裂解30 min后收取蛋白液，采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%BSA封閉1 h，后加入CTGF抗體(1∶100)，4 ℃過液，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法顯色，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-378*隨供體年齡增加而表達上調(diào)

通過Affymetrixr GeneChip 2.0 miRNA芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-378*隨供體年齡的增加而表達上調(diào)，見圖1A。通過qRT-PCR檢測，我們進一步證實，與年青組相比，年老組hMSCs中miR-378*表達上調(diào)4.71倍，見圖1B。

Figure 1.Alternation of miR-378* and CTGF expression in aged hMSCs. A: miR-378* expression in young (Y) and old (O) hMSCs was determined by microarray analysis； B: miR-378* expression in Y, O， control(C) and H2O2(H) treated hMSCs was determined by qRT-PCR； C: CTGF mRNA expression in Y, O， C and H2O2(H) treated hMSCs； D: CTGF protein expression in Y and O hMSCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsY;#P<0.05vsC.

圖1 供體年齡對hMSCs中miR-378*及CTGF表達的影響

2 H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡

H2O2刺激可減少hMSCs存活，誘導(dǎo)hMSCs凋亡。通過MTT、LDH和caspase-3/7檢測，我們發(fā)現(xiàn)H2O2刺激使hMSCs細胞存活率下降，LDH和caspase-3/7活性升高，見圖2D～F。并且，H2O2可促進hMSCs中miR-378*的表達，抑制CTGF的表達，見圖1B～D。

Figure 2.Effects of miR-378* and CTGF on hMSC survival and apoptosis. A: up-regulated miR-378* expression in hMSCs by miR-378* mimic (M) and down-regulated miR-378* expression in hMSCs by miR-378* inhibitor (I)； B and C: the mRNA and protein expression of CTGF in hMSCs transfected with miR-378* mimic, miR-378* inhibitor, si-CTGF (S), or miR-378* inhibitor and si-CTGF (I+s)； D, E and F: MTT, LDH and caspase-3/7 assays of young (Y), old (O) or H2O2-treated hMSCs which transfected with miR-378* mimic, miR-378* inhibitor, si-CTGF, or miR-378* inhibitor and si-CTGF.C1～3： controls. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsC1;#P<0.05vsC2;△P<0.05vsY;▲P<0.05vsY+H2O2.

圖2 miR-378*及CTGF對hMSCs存活與凋亡的調(diào)控作用

3 miR-378*促進H2O2誘導(dǎo)的hMSCs凋亡

轉(zhuǎn)染miR-378*模擬物，可在hMSCs中過表達miR-378*(上調(diào)5.1倍)；相反，轉(zhuǎn)染miR-378*抑制物，可抑制miR-378*的表達(下調(diào)0.21倍)，見圖2A。過表達miR-378*后，通過MTT、LDH、caspase-3/7檢測及TUNEL染色，我們發(fā)現(xiàn)hMSCs細胞存活率下降(MTT檢測，下調(diào)0.58倍)，細胞凋亡增加；LDH活性上調(diào)1.75倍；caspase-3/7活性上調(diào)1.28倍；TUNEL染色陽性率上調(diào)8.14倍。相反，抑制miR-378*表達后，hMSCs細胞存活率提高(MTT檢測，上調(diào)1.24倍)，細胞凋亡減少；LDH活性下調(diào)0.58倍；caspase-3/7活性下調(diào)0.83倍；TUNEL染色陽性率下調(diào)0.36倍，見圖2D～F及圖3。

Figure 3.Effects of miR-378* and CTGF on hMSC apoptosis [TUNEL (red) and DAPI (blue) staining，×200].Mean±SD.n=3.*P<0.05vsC1;#P<0.05vsC2;△P<0.05vsY.

圖3 TUNEL檢測miR-378*及CTGF對hMSCs凋亡的調(diào)控作用

4 miR-378*通過抑制CTGF表達發(fā)揮調(diào)控作用

通過qRT-PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)與年青組相比，年老組hMSCs中CTGF表達下調(diào)0.24倍，見圖1C。H2O2刺激后引起hMSCs中miR-378*表達上調(diào)時，CTGF表達下調(diào)0.27倍，見圖1B、C。轉(zhuǎn)染miR-378*模擬物在hMSCs中過表達miR-378*時，CTGF表達下調(diào)0.49倍，而在hMSCs中抑制miR-378*表達時，CTGF表達升高3.31倍；通過si-CTGF，我們可在hMSCs中抑制CTGF mPNA及蛋白的表達(下調(diào)0.19倍)，見圖2B、C。在H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡過程中，直接抑制CTGF的表達，使hMSCs存活率下降(MTT檢測，下調(diào)0.55倍)，細胞凋亡增加；LDH活性上調(diào)2倍；caspase-3/7活性上調(diào)1.31倍；TUNEL染色陽性率上調(diào)6.22倍。而在hMSCs中同時抑制miR-378*及CTGF表達后，使抑制miR-378*所引起的細胞存活增加、凋亡減少的作用消失，見圖2D～F及圖3。

討 論

本課題組前期研究證實，隨供體年齡改變而差異表達的miRNAs，與年齡因素引起的hMSCs功能改變相關(guān)，例如：miRNAs表達的改變可能與細胞增殖、分化、衰老及凋亡相關(guān)。本研究進一步探討了miR-378*對hMSCs存活和凋亡的調(diào)控作用及其機制。我們發(fā)現(xiàn)miR-378*可通過抑制CTGF的表達，促進細胞凋亡，減少細胞存活。

研究證實microRNA參與調(diào)控細胞生存、復(fù)制、衰老、增殖及分化等過程，其中在最近的研究中，miR-378家族被證實參與多種細胞功能的調(diào)控。例如：在抑制miR-378*表達轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-378*可以通過上調(diào)整合素β3及波形蛋白的表達，促進傷口愈合[5]。Zhang等[6]在結(jié)直腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-378是一種抑癌因子，可通過抑制其靶基因波形蛋白的表達，抑制腫瘤的增殖和侵襲。然而，由于信號通路調(diào)控機制和細胞類型的不同，miR-378家族對細胞存活和凋亡的調(diào)控作用尚無定論。例如：在人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞株(U87)、乳腺癌細胞株(MT-1)及混合腫瘤細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-378*可以抑制轉(zhuǎn)錄因子SuFu和Fus-1的表達，促進腫瘤細胞存活，腫瘤組織生長及血管生成[7]。而相反，Kim等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在電刺激預(yù)處理的小鼠心臟干細胞中過表達miR-378，使電刺激的細胞保護作用喪失，通過LDH釋放和TUNEL染色檢測發(fā)現(xiàn)，過表達miR-378使細胞的存活能力下降。在小鼠心肌細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-378隨供體年齡的增加而表達上調(diào)。miR-378通過抑制IGF1R和Akt信號途徑，促進心肌細胞凋亡[4]。與此結(jié)果類似，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-378*的表達隨hMSCs供體年齡的增加而升高，miR-378*可促進hMSCs凋亡。

一個microRNA可能調(diào)控多個靶基因，多個microRNA也可能只調(diào)控一個靶基因。研究證實miR-378*可調(diào)控多種蛋白的表達，例如整合素β3、波形蛋白、Nodal 蛋白、纖連蛋白等[5, 7]。而與Kim等[8]的研究結(jié)果類似，我們發(fā)現(xiàn)miR-378*可以抑制CTGF基因及蛋白的表達。CTGF被證實不僅可調(diào)控黏附、遷移、增殖、分化、衰老、存活和凋亡等細胞功能，而且也被證實可參與調(diào)控血管生成、成骨細胞分化、成軟骨細胞分化、傷口愈合和動脈硬化等生物過程[9]。例如：在細胞存活、凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，CTGF可以減少缺氧應(yīng)激等細胞微環(huán)境改變引起的細胞損傷，減少缺氧應(yīng)激引起的胰腺癌細胞凋亡，促進腫瘤生長[10]。而在人橫紋肌肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制CTGF的表達可促進細胞凋亡，減少細胞存活和向成肌細胞分化[11]。 同樣，在CTGF基因敲除小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，敲除CTGF基因后，小鼠肺細胞增殖能力下降，凋亡增加，最終導(dǎo)致小鼠肺組織發(fā)育不良[12]。Tsai等[13]在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，CTGF可以通過促進生存蛋白的表達，減少紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡。與這些研究結(jié)果類似，我們的研究證實，CTGF隨hMSCs供體年齡的增加而表達下調(diào)。進一步的功能實驗證實，CTGF的表達下降是引起hMSCs存活下降和凋亡增加的主要因素。

我們的研究發(fā)現(xiàn)：miR-378*隨hMSCs供體年齡的增加而表達上調(diào)，從而抑制了其靶基因CTGF的表達，導(dǎo)致hMSCs存活下降和凋亡增加。本課題闡述了miR-378*調(diào)控hMSCs存活及凋亡的機制，為年齡相關(guān)microRNAs——miR-378*的運用提供了理論基礎(chǔ)和新的研究方向。

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MicroRNA-378*enhances apoptosis of human mesenchymal stem cells by repressing expression of CTGF

DONG Jun1,3, ZENG Bo-hang1, LIU Ning-ning3, MO Pei2, XIONG Long-gen2,3, LIU Shi-ming2,3, LI Jiao2,3

(1DepartmentofOncology,2DepartmentofCardiology,3GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,TheSecondAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,China.E-mail:gzlijiao@163.com)

AIM: To investigate the effects of microRNA-378* (miR-378*) on the survival and apoptosis of human mesenchymal stem cells (hMSCs). METHODS: The expression of miR-378* was determined by microRNA arrays and quantitative real-time PCR (qRT-PCR). H2O2was used to induce hMSCs apoptosis. By transfection of miR-378* mimic or inhibitor, we up-regulated or down-regulated miR-378* expression in hMSCs. The effect of miR-378* and connective tissue growth factor (CTGF) on hMSC survival and apoptosis were detected by MTT, LDH, caspase-3/7 and TUNEL assays. RESULTS: The expression of miR-378* was up-regulated in the old hMSCs compared with the young hMSCs. H2O2increased the expression of miR-378*, decreased the expression of CTGF. Up-regulation of miR-378* resulted in increasing apoptosis and decreasing survival of hMSCs. Conversely, down-regulation of miR-378* resulted in decreasing cell apoptosis and increasing survival. The regulation of miR-378* on hMSC apoptosis and survival was attenuated by inhibiting the expression of miR-378* and CTGF together. Direct repression of CTGF expression inhibited the hMSC survival and increased apoptosis. CONCLUSION: miR-378* enhances apoptosis of hMSCs by repressing the expression of CTGF.

Human mesenchymal stem cells; MicroRNA-378*; Apoptosis

1000- 4718(2014)12- 2238- 05

2014- 07- 11

2014- 07- 30

國家自然科學(xué)基金青年項目(No. 81401156)； 廣州市屬高?？蒲杏媱濏椖?No. 2012C232)；廣州醫(yī)科大學(xué)博士科研項目(No. 2012C42)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.021

△ 通訊作者 Tel: 020-34153522; E-mail: gzlijiao@163.com