王新施， 曾慶意， 朱振國(guó)， 朱 攀， 徐惠琴， 鄭榮遠(yuǎn)

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

咪唑克生對(duì)EAE小鼠血腦屏障通透性及對(duì)MMP-9/TIMP-1的影響*

王新施， 曾慶意， 朱振國(guó)， 朱 攀， 徐惠琴， 鄭榮遠(yuǎn)△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

目的： 觀察咪唑克生(idazoxan，IDA)對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)時(shí)血腦屏障(BBB)通透性及脊髓內(nèi)的MMP-9/TIMP-1表達(dá)的影響。 方法: 選用36只8周左右的C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、EAE組和IDA干預(yù)組，每組12只，采用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)誘導(dǎo)經(jīng)典EAE模型，干預(yù)組采用IDA 2 mg/kg腹腔注射，每天2次，共15 d。觀察每組大鼠發(fā)病情況并進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分，采用HE染色和LFB髓鞘染色觀察病理改變，采用伊文思藍(lán)熒光定量方法檢測(cè)BBB通透性的變化，并用Western blotting法檢測(cè)MMP-9和TIMP-1的表達(dá)。結(jié)果: 空白對(duì)照組無(wú)一發(fā)病，與EAE組比較， IDA干預(yù)組神經(jīng)功能障礙評(píng)分明顯下降，炎性病灶明顯減少，BBB通透性明顯降低，MMP-9的表達(dá)和MMP-9/TIMP-1比值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: IDA可能通過(guò)下調(diào)MMP-9，降低MMP-9/TIMP-1比值，減輕血腦屏障的降解破壞，從而穩(wěn)固BBB，降低BBB通透性，減緩小鼠EAE的發(fā)病。

咪唑克生; 血腦屏障; 基質(zhì)金屬蛋白酶9; 組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1; 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種以血管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘破壞為主要病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的臨床表現(xiàn)和病理改變與其極為相似，被公認(rèn)為是MS的動(dòng)物模型。 由于它們的病因或發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，防治也無(wú)理想的特效藥物，于是成為有待深入探索的重大理論研究課題。有證據(jù)表明在MS/EAE活動(dòng)期,基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)或MMP-9抑制物組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1， TIMP-1)的平衡失調(diào)，導(dǎo)致MMP-9活性明顯增加，進(jìn)而降解血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)，導(dǎo)致BBB開(kāi)放，在EAE/MS的發(fā)病中起了重要作用[1]。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦幸寻l(fā)現(xiàn)咪唑啉2受體(imidazoline 2 receptor，I2R)的配體咪唑克生(idazoxan，IDA)對(duì)大鼠EAE有明顯緩減發(fā)病的作用[2-3]，然而該保護(hù)作用的機(jī)制不甚清楚，其對(duì)小鼠EAE的影響及對(duì)MMP-9/TIMP-1及BBB通透性的影響目前尚未有報(bào)道。本文旨在通過(guò)觀察IDA對(duì)小鼠EAE的保護(hù)作用，檢測(cè)分析EAE組與IDA干預(yù)組的BBB通透性及MMP-1/TIMP-1表達(dá)的變化，探討IDA對(duì)EAE發(fā)生后BBB通透性的保護(hù)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

36只雌性C57BL/6小鼠，清潔級(jí)，6～8周齡，體重18～20 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55 (myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55) 由西安美聯(lián)生物科技有限公司合成，純度>95%。人結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis，H37Ra)購(gòu)自Difco；IDA、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)、百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、伊文思藍(lán)和IDA購(gòu)自Sigma；MMP-9抗體購(gòu)自Abcam，TIMP-1抗體購(gòu)自Santa Cruz。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 EAE模型的制備 采用MOG35-55作為致敏抗原誘導(dǎo)EAE模型，按目前公認(rèn)的及本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法進(jìn)行。用IFA將H37Ra稀釋成0.008 mg/L的完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)， 用0.01 mol/L的PBS 將MOG35-55稀釋成2.22g /L，然后將MOG稀釋液與CFA等體積冰浴，快速混勻10 min至油包水狀態(tài)，制成抗原乳劑。造模小鼠背部?jī)蓚?cè)分4點(diǎn)皮下注射抗原乳劑0.2 mL/只。免疫后當(dāng)時(shí)和48 h給予小鼠腹腔注射PT(0.53 g/L，每只0.2 mL)。自免疫當(dāng)天開(kāi)始，每日觀察小鼠的發(fā)病情況并進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。

2.2 給藥和分組 36只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為：(1)IDA干預(yù)組：按照以上方法制備EAE模型后，從免疫第1天開(kāi)始，給予IDA 2 mg/kg腹腔注射給藥，每隔12 h注射1次(q12h)，連續(xù)14 d；(2)EAE組：按照以上方法制備EAE模型后，腹腔注射等量的生理鹽水，q12h，連續(xù)14 d；(3)正常對(duì)照組：以PBS代替MOG35-55+CFA免疫后，腹腔注射等量的生理鹽水，q12h，連續(xù)14 d，作為對(duì)照。

2.3 神經(jīng)功能障礙評(píng)分 免疫當(dāng)天起，每日觀察小鼠發(fā)病情況并進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分，采用Weaver 15分法進(jìn)行評(píng)分[4]：(1)尾巴：0分為無(wú)異常，1分為尾半癱，2分為尾巴全癱；(2)單一肢體：0分為無(wú)異常，1分為步態(tài)改變，2分為輕癱，3 分為全癱。以上累積評(píng)分，如尾巴和四肢全癱則為 14 分，瀕死為 15分。

2.4 病理學(xué)檢查 各組隨機(jī)取6只動(dòng)物在EAE發(fā)病高峰期麻醉后斷頭處死，取出腦組織，4%多聚甲醛固定；常規(guī)石蠟包埋、切片。進(jìn)行HE染色觀察腦與脊髓的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，采用5分法進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)分[5]：于高倍鏡下計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞，0 分= 無(wú)炎癥細(xì)胞；1 分=炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)限于血管周圍和脊髓周圍；2分=脊髓內(nèi)炎癥細(xì)胞輕微浸潤(rùn)(1～10個(gè)/視野)；3分=脊髓內(nèi)炎癥細(xì)胞中度浸潤(rùn)(10～100 個(gè) / 視野)；4分：脊髓內(nèi)炎癥細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)(>100 個(gè)/視野)。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野后取平均值。同時(shí)切片進(jìn)行LFB髓鞘染色，鏡下觀察髓鞘脫失程度，髓鞘染為藍(lán)色，脫失后呈白色脫失斑塊。并按照Kuerten等[6]的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)髓鞘脫失程度進(jìn)行5分法評(píng)分：1分=微量軟腦膜下髓鞘脫失； 2分=明顯的軟腦膜下和血管周圍髓鞘脫失； 3分=融合成片的軟腦膜下和血管周圍髓鞘脫失； 4分=大片的軟腦膜下和血管周圍髓鞘脫失包括一半以上的脊髓實(shí)質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)； 5=廣泛的軟腦膜下和血管周圍髓鞘脫失包括全部的脊髓實(shí)質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.5 BBB通透性檢測(cè) 各組隨機(jī)選取6只動(dòng)物則于疾病高峰期或免疫后24 d處死，按照Uyama 等[7]的方法, 采用伊文思藍(lán)熒光定量方法檢測(cè)BBB通透性的變化。在發(fā)病高峰期用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.35 g/kg體重)，從股靜脈注入2% 伊文思藍(lán)生理鹽水溶液(4 mL/kg)1 h 后，開(kāi)胸通過(guò)左心室灌注生理鹽水(灌注壓為110 mmHg)，直到右心房流出的液體呈無(wú)色為止，斷頭取腦。腦組織稱重并置入50%三氯乙酸溶液中，勻漿和離心(10 000 r/min, 20 min) 后, 取上清液按1∶3 的比例用乙醇稀釋。其熒光值通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)得，根據(jù)伊文思藍(lán)溶液(100～500 mg/L) 的外在標(biāo)準(zhǔn)繪出伊文思藍(lán)與熒光值之間的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出腦組織中伊文思藍(lán)的含量，并用每克組織含量來(lái)表示。

2.6 Western blotting檢測(cè)MMP-9和TIMP-1的表達(dá) 在制作上述病理學(xué)檢查標(biāo)本時(shí)留取不同組別的頸髓組織，切成小塊放入離心管中。加入預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑，用勻漿器低速勻漿后，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。用BCA蛋白定量方法測(cè)定MMP-9和TIMP-1蛋白的含量，并調(diào)整蛋白濃度。取等量的蛋白樣品(50 mg)經(jīng)20% SDS-PAGE分離蛋白樣品，4 ℃濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF 膜在5% BSA 溶液中室溫孵育1 h，然后加入稀釋的MMP-9 (1∶1 000)及TIMP-1(1∶500)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗 IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min，3 次。將膜置于KCTM 化學(xué)發(fā)光試劑盒中室溫孵育3 min后以X 光膠片曝光成像，用ImageJ 圖像分析軟件分析各條帶的平均灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料(發(fā)病率)的比較則采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠發(fā)病情況

小鼠于免疫后第10 天左右開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病，先表現(xiàn)為活動(dòng)減少、進(jìn)食少、體重減輕，繼而陸續(xù)出現(xiàn)尾肌力降低、尾巴拖地不能抬起、后肢無(wú)力、步態(tài)異常、癱瘓等。其癥狀在發(fā)病后2～10 d逐漸加重達(dá)到高峰，持續(xù)1～6 d后開(kāi)始緩解?？瞻讓?duì)照組動(dòng)物無(wú)一發(fā)病，EAE組12只動(dòng)物全部發(fā)病，發(fā)病率達(dá)到100%，IDA干預(yù)組12只動(dòng)物有10只發(fā)病，較EAE組發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而IDA干預(yù)組動(dòng)物的最大神經(jīng)功能障礙評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2 病理組織學(xué)結(jié)果

空白對(duì)照組HE染色未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；EAE組可見(jiàn)輕中度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；給予IDA后，腦和脊髓浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞數(shù)較EAE組明顯減少，病理組織學(xué)評(píng)分較EAE組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。LFB髓鞘染色見(jiàn)發(fā)病小鼠CNS內(nèi)有大小不等的片狀髓鞘脫失，給予IDA后，發(fā)病動(dòng)物腦和脊髓的脫髓鞘改變較EAE組明顯減輕，脫髓鞘評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表1。

表1 各組小鼠發(fā)病率、神經(jīng)功能障礙和病理組織學(xué)評(píng)分

TableP<0.05 ,**P<0.01vsEAE.

Figure 1.The infiltration of inflammatory cells in mouse brain tissue detected by HE staining (×400). A: control group; B: EAE group; C: IDA group.

圖1 小鼠腦組織HE染色所見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況

Figure 2.The demyelination in mouse brain tissues detected by LFB staining (×400). A:control group; B: EAE group; C: IDA group.

圖2 小鼠腦組織LFB髓鞘染色

3 BBB通透性檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量很少，EAE組腦內(nèi)有大量的伊文思藍(lán)浸潤(rùn)，而IDA干預(yù)組腦內(nèi)浸潤(rùn)的伊文思藍(lán)含量明顯減少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示EAE組小鼠BBB通透性較正常對(duì)照組明顯增加，而給予IDA干預(yù)后BBB得到穩(wěn)固，其通透性明顯降低，見(jiàn)表2。

4 MMP-9和TIMP-1的Western印跡法檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠頸髓組織標(biāo)本的Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，EAE組的MMP-9表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高，而IDA干預(yù)組的MMP-9較EAE組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 EAE組的TIMP-1較空白對(duì)照組有降低趨勢(shì)，IDA干預(yù)組TIMP-1與EAE組比較有升高趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而EAE組的MMP-9/TIMP-1比值較空白對(duì)照組明顯升高，而IDA干預(yù)組的MMP-9/TIMP-1比值較EAE組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3、表2。

Figure 3.The expression of MMP-9 and TIMP-1 protein detected by Western blotting.

圖3 小鼠頸髓組織標(biāo)本MMP-9及TIMP-1蛋白的表達(dá)

表2 各組BBB通透性和MMP-9/TIMP-1灰度比值結(jié)果

Table 2.The BBB permeability detected by Evans blue extravasation and expression of MMP-9/TIMP-1 detected by Western blotting (Mean±SD.n=6)

GroupEBcontent(mg/g)MMP-9/β-actinTIMP-1/β-actinMMP-9/TIMP-1EAE17.32±0.900.63±0.090.52±0.081.25±0.27IDA13.26±0.59**0.52±0.08**0.61±0.080.92±0.20**Control1.25±0.12**0.31±0.04**0.55±0.080.57±0.09**

*P<0.01vsEAE.

討 論

過(guò)去我們?cè)^察到IDA 1.5、 2、 4.5 mg/kg均有明顯減緩Wistar大鼠EAE發(fā)病的作用[2-3]，但I(xiàn)DA對(duì)其它種屬動(dòng)物的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6小鼠，根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇了中間2 mg/kg的劑量，結(jié)果進(jìn)一步在小鼠身上驗(yàn)證了IDA(2mg/kg)減緩EAE的保護(hù)作用。結(jié)合2種不同鼠種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示IDA在1.5～4.5 mg/kg這個(gè)劑量范圍內(nèi)確實(shí)具有減緩EAE的保護(hù)作用，為IDA進(jìn)一步應(yīng)用于其它動(dòng)物甚至人類提供了理論支持。除此之外，本實(shí)驗(yàn)最重要的發(fā)現(xiàn)是首次觀察到了IDA干預(yù)后，MMP-9或MMP-9/TIMP-1比值明顯下降，使得MMP-9活性降低，BBB破壞減輕，通過(guò)EB熒光定量法檢測(cè)到的BBB通透性降低。

血腦屏障功能失調(diào)是MS/EAE的一個(gè)重要病理途徑，研究發(fā)現(xiàn)，在EAE發(fā)病時(shí)及MS臨床復(fù)發(fā)時(shí)都存在BBB功能失調(diào)，BBB通透性增加，導(dǎo)致外周炎癥細(xì)胞和炎癥因子向中樞遷移，是EAE/MS發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，BBB的通透性與EAE的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]。但EAE/MS中BBB破壞的機(jī)制仍不明確。EAE/MS時(shí)，中樞的炎癥因子如腫瘤壞死因子α等能誘發(fā)MMP-9的產(chǎn)生[9]，MMP-9作為最重要的降解BBB的酶，不但能降解Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白等基底膜的主要成分，也能降解BBB緊密連接蛋白ZO-1, 導(dǎo)致BBB開(kāi)放，炎癥細(xì)胞和炎癥因子進(jìn)入CNS誘發(fā)MS/EAE[10]。在MS/EAE活動(dòng)期，MMP-9濃度升高，或者M(jìn)MP-9與其抑制物TIMP-1的平衡失調(diào)導(dǎo)致MMP-9活性明顯增加，被認(rèn)為是MS/EAE的一個(gè)重要活動(dòng)性標(biāo)志[11]。MMP-9的水平高低被認(rèn)為與MS的病情嚴(yán)重程度、藥物抵抗性等直接相關(guān)，即EDSS評(píng)分較高和藥物抵抗的MS病人血漿的MMP-9水平明顯升高[12], 而在動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)EAE小鼠的病情越重、MMP-9水平越高的現(xiàn)象[13]。

與以往的這些研究一致，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)EAE組小鼠頸髓組織的MMP-9濃度較正常對(duì)照組明顯升高，同時(shí)BBB通透性也明顯升高。而IDA 2 mg/kg腹腔注射給藥、q12h、連續(xù)14 d干預(yù)后，EAE小鼠的行為學(xué)和病理組織學(xué)改變明顯減輕的同時(shí)，MMP-9或MMP-9/TIMP-1比值明顯下降，通過(guò)EB熒光定量法檢測(cè)到的BBB通透性明顯降低，提示IDA可能通過(guò)降低MMP-9活性，減輕EAE時(shí)的BBB破壞，從而起到減緩EAE的作用。實(shí)際上，降低MMP-9或者M(jìn)MP-9/TIMP-1比值、穩(wěn)固BBB早已是MS/EAE一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是作為MS急性期主要治療藥物的糖皮質(zhì)激素，還是作為MS緩解期主要治療藥物的IFN-β，其治療作用都與降低MS病人外周血的MMP-9水平[14]或逆轉(zhuǎn)病人血清/腦脊液MMP-9/TIMP-1的平衡失調(diào)[15]，從而降低BBB通透性有關(guān)[16-17]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也預(yù)示著IDA有望和糖皮質(zhì)激素及IFN-β一樣成為治療MS的重要藥物。

綜上所述，IDA慢性干預(yù)能減緩小鼠EAE的發(fā)病，減輕EAE小鼠的中樞炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘改變，這些作用可能與IDA下調(diào)MMP-9或MMP-9/TIMP-1，從而穩(wěn)固BBB、降低BBB的通透性有關(guān)。

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Effect of idazoxan on permeability of blood-brain barrier and expression of MMP-9/TIMP-1 in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis

WANG Xin-shi, ZENG Qing-yi, ZHU Zhen-guo, ZHU Pan, XU Hui-qin, ZHENG Rong-yuan

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:zhengry2013@163.com)

AIM: To study the effect of idazoxan (IDA) on the permeability of blood-brain barrier (BBB) and the expression of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).METHODS: Female C57BL/6 mice (n=36) were randomly divided into control group, EAE group and IDA group, with 12 mice in each group. EAE was induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55). IDA (2 mg/kg, ip, bid) was administered for 15 d after immunization. The neurological defects of the mice were observed daily and scored. The pathological changes were observed under microscope with HE staining and LFB myelin staining. The BBB permeability was detected by Evans blue extravasation. The expression of MMP-9 and TIMP-1 in the brain of EAE mice was determined by Western blotting.RESULTS: Compared with EAE group, the score of neurological defects in IDA group was decreased, the inflammation was relieved, the BBB permeability was reduced, and the expression MMP-9 and the ratio of MMP-9/TIMP-1 were decreased (P<0.05).CONCLUSION: The neuroprotective effect of IDA on mouse EAE might be related to the down-regulation of MMP-9 and the ratio of MMP-9/TIMP-1, thus reducing the degradation of BBB and the permeability of BBB, and ameliorating the pathologic process of EAE.

Idazoxan; Blood-brain barrier; Matrix metalloproteinases 9; Tissue inhibitor of metalloproteinase 1; Experimental autoimmune encephalomyelitis

1000- 4718(2014)12- 2254- 05

2014- 07- 10

2014- 09- 16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81070960)； 浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LQ12H09002)

R363； R774.5+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.024

△ 通訊作者 Tel: 0577-55589361; E-mail: zhengry2013@163.com