于 鵬，孫 偉，張國慶

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，烏魯木齊 830011）

食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，且我國食管癌發(fā)病率具有明顯的地域特點，新疆是我國食管癌高發(fā)省份之一。過去認為飲食和不良生活習(xí)慣與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)，但卻并不能完全解釋食管癌發(fā)病過程中存在的明顯地域、民族差異和高發(fā)區(qū)明顯的家庭聚集現(xiàn)象［1－2］，提示遺傳學(xué)等因素可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在認為腫瘤的發(fā)生是因為腫瘤細胞脫離細胞對它的調(diào)控，導(dǎo)致其生長速度遠遠大于其發(fā)生凋亡的速度，最終的結(jié)果是細胞數(shù)量的過度積累，導(dǎo)致腫瘤的形成［3］。凋亡相關(guān)基因程序化細胞死亡分子5（PDCD5）是由北京大學(xué)人類疾病基因中心克隆得到的凋亡相關(guān)基因，許多臨床常見腫瘤組織中檢測到PDCD5表達下降，認為PDCD5表達降低可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［4－5］。本研究探討PDCD5啟動子區(qū)CpG島在新疆維吾爾族和漢族食管鱗癌中的甲基化情況，分析是否存在民族差異及其與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 從新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫中選取2008年1月－2012年6月食管鱗癌患者術(shù)后標(biāo)本40例，其中男性27例，女性13例，維吾爾族、漢族患者各20例（Ⅱ期、Ⅲ期各10例）。年齡56～69歲，中位年齡61歲?；颊咝g(shù)前均未接受過放化療及抗腫瘤治療，術(shù)后病理證實為鱗癌。按照病例對照研究的要求，選取癌旁組織（距離癌腫距離＞5cm）作為對照。所有標(biāo)本均于術(shù)后30min內(nèi)獲取，液氮速凍后－80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑和儀器 DNA純化試劑盒購自Thermo公司，甲基化試劑盒購自美國ZYMO research科技開發(fā)有限公司，甲基化引物由上海生工合成，高保真熱啟動酶購自德國凱杰公司。

1.3 方法

1.3.1 組織基因組DNA的提取 取20mg組織放于研缽中，在液氮中迅速研磨至粉末狀，收集到1.5mL EP管中，加入20μL蛋白酶K和180μL組織消化液，置于56℃水浴鍋中孵育3h，其余步驟嚴(yán)格按照說明書操作，提取的DNA用核酸蛋白分析儀測定濃度，A260／A280均應(yīng)介于1.8～2.0，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA 取20μL純化的DNA，按照試劑盒說明書的步驟對DNA進行甲基化處理，用洗脫液對處理過的DNA進行回收，回收的DNA可立即進行下一步分析或－20℃短時間保存，若需長時間存放需置于－80℃冰箱。

1.3.3 甲基特異性PCR 擴增在 http：／／genome.ucsc.edu網(wǎng)站上查找基因啟動子區(qū)序列，用CpG Island Searcher查找CpG島，用Methyl Primer Express v1.0軟件設(shè)計引物（表1）。

1.3.4 PCR反應(yīng)體系 PCR取20μL體系 ，反應(yīng)條件：10×PCR Buffer 2μL，dNTP Mix 0.5μL，引物A、引物B各0.5μL，Hotstartaq DNA Polymerase 0.2μL，模板 DNA 2μL，ddH2O 14.3μL。PCR反應(yīng)溫度：預(yù)變性95℃，15min；變性94℃，30 s；退火溫度：（甲基化引物：53℃；非甲基化引物：49℃）；延伸：72℃，1min，共25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳30min，凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果。

表1 PDCD5基因啟動子區(qū)甲基化檢測引物

1.3.5 結(jié)果判定 甲基化特異性引物擴增陽性者記為完全甲基化；甲基化特異性引物與非甲基化特異性引物擴增陽性者記為不完全甲基化，均視為甲基化陽性；非甲基化特異性引物擴增陽性者記為未甲基化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性檢驗采用雙變量關(guān)聯(lián)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDCD5在食管鱗癌組織和癌旁組織中基因啟動子區(qū)甲基化分析結(jié)果 癌組織中PDCD5啟動子區(qū)甲基化陽性率為80.0%（32／40），其中3例發(fā)生完全甲基化，29例發(fā)生不完全甲基化。癌旁組織中甲基化率為35.0%（14／40），其中1例發(fā)生完全甲基化，13例發(fā)生不完全甲基化。癌組織與癌旁組織甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝16.57，P＜0.05）（圖1）。

2.2 PDCD5在漢族和維吾爾族食管鱗癌患者中基因啟動子區(qū)甲基化分析結(jié)果 漢族和維吾爾族食管鱗癌中PDCD5啟動子區(qū)甲基化陽性率分別為90.0%（18／20）和70.0%（14／20），差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＞0.05）。

圖1 MSP法檢測PDCD5在不同組織中基因甲基化結(jié)果

2.3 PDCD5基因啟動子區(qū)甲基化與食管鱗癌患者臨床分期的關(guān)系 不同民族、性別、年齡食管鱗癌中PDCD5啟動子區(qū)甲基化陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），與腫瘤的臨床分期相關(guān) （P ＜0.05），見表2。

表2 PDCD5基因啟動子區(qū)甲基化情況與食管鱗癌臨床分期的關(guān)系／例（%）

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多基因改變和多階段的復(fù)雜過程，除DNA序列改變外，表觀遺傳學(xué)改變在其形成過程中也具有重要作用，其中DNA甲基化是研究最為深入的一種機制。DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)的表觀修飾方式之一，也成為近些年來人們研究腫瘤發(fā)生機制的熱點。

PDCD5定位于19號染色體，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，全長約有6kb個基因。第25～399位基因閱讀框編碼125個氨基酸的蛋白質(zhì)。趙杰等［6］對PDCD5基因上游區(qū)域的研究顯示，在轉(zhuǎn)錄起始密碼子之前有一個重要的轉(zhuǎn)錄起始點，由72個堿基對組成，其上游缺少TATA框和CAAT框。此區(qū)域具有極強的啟動子活性，其中－555到－383區(qū)域與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而研究表明［6］在細胞凋亡過程中PDCD5基因可能是一些凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的靶向基因。許多臨床常見腫瘤組織中檢測到PDCD5表達下降。PDCD5的表達下降多與腫瘤組織凋亡信號抑制有關(guān)，并且在胃癌、卵巢癌、兒童惡性腫瘤［7－8］中檢測到PDCD5基因表達產(chǎn)物下降，并且隨腫瘤分級的升高，PDCD5蛋白下降更為明顯。

本研究結(jié)果顯示食管鱗癌組織中PDCD5基因啟動子區(qū)甲基化陽性率為80.0%（32／40）高于癌旁組織的35.0%（14／40），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明PDCD5啟動子區(qū)甲基化與食管鱗癌的發(fā)生存在相關(guān)性。孫偉等［5］采用RT－PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測40例食管鱗癌組織和癌旁組織中PDCD5基因mRNA和蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中PDCD5基因mRNA和蛋白的表達均低于癌旁組織，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果進一步顯示食管鱗癌組織中PDCD5基因甲基化陽性率高于癌旁組織，結(jié)合表觀遺傳學(xué)的知識可以猜想可能是因為該基因啟動子區(qū)高甲基化，導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄受阻，進一步影響到蛋白的表達。然而，目前尚無有力的證據(jù)能明確證實這一猜想，因此還有待于更多試驗結(jié)果的支持。本研究結(jié)果顯示PDCD5基因CpG島的甲基化與患者的民族、性別、年齡無相關(guān)性，提示在新疆漢族和維吾爾族食管鱗癌的發(fā)生機制無差別，提示食管癌的發(fā)生主要涉及基因?qū)用妫劣谛陆貐^(qū)哈薩克族食管癌的發(fā)病率顯著高于其他民族的原因可能是由于飲食及其他生活習(xí)慣造成的，提示腫瘤的發(fā)生是一種基因病，而環(huán)境因素是這一過程的始動因素。本研究顯示癌組織與癌旁組織均存在一定數(shù)量的不完全甲基化個體，提示甲基化在食管鱗癌的發(fā)生過程中可能存在時間和劑量累積的過程，這就可以解釋為什么生活在同一地區(qū)的人群而食管癌的發(fā)生率卻不盡相同，其中腫瘤易感性是其中一個方面，而致癌因素的累積效應(yīng)可能是另一方面。并且二者啟動子區(qū)甲基化與臨床腫瘤分期相關(guān)，分期高的甲基化程度相對較高，這一現(xiàn)象進一步驗證了甲基化存在劑量和時間的累計這一假設(shè)。此結(jié)果與程雷等［9］和胡華梅等［10］的報道結(jié)果相一致。

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