王曉靜，魏 琴，吳鴻濤，楊 凱，娜仁花，王 寧

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1干部病房?jī)?nèi)一科，2臨床研究中心，烏魯木齊 830054）

胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的重要特征，同時(shí)在代謝綜合征的形成中也起著關(guān)鍵的作用，胰島素抵抗的發(fā)生與肥胖、高血壓、冠心病等疾病有明顯關(guān)系。大量的研究已經(jīng)表明肥胖（尤其是內(nèi)臟型肥胖）是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要因素［1－3］。Toll樣受體（TLR）在炎癥因子基因啟動(dòng)以及炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中有非常重要的地位。Toll樣受體4（TLR4）在自然配體（LPS）作用下，導(dǎo)致核因子－kappa B（NF－κB）激活，從而釋放大量炎癥因子，致使胰島素抵抗的發(fā)生［4］。釋放的大量炎癥因子中包括腫瘤壞死因子（TNF－α）、白介素6（IL－6）等，TNF－α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也能產(chǎn)生，TNF－α通過(guò)與p55RNFR結(jié)合，繼而激活并水解中性神經(jīng)鞘磷脂酶，引起胰島素底物受體（IRS－1）絲氨酸磷酸化，最終導(dǎo)致胰島素生物功能下降，發(fā)生胰島素抵抗。白介素（IL）是在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞因子，有關(guān)研究［5］發(fā)現(xiàn)在胰島素抵抗機(jī)體中白介素6（IL－6）水平明顯升高，可能是參與了炎癥反應(yīng)，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究，既往對(duì)于研究骨骼肌、脂肪細(xì)胞中TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)以及其炎癥因子表達(dá)的影響的相關(guān)報(bào)道較多［6］，但關(guān)于TLR4在胰腺組織中的信號(hào)傳導(dǎo)研究較少。本研究通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠肥胖模型，觀察高脂飲食小鼠胰腺組織中TLR4表達(dá)對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響，以及對(duì)胰島素敏感性的影響。

1 材料與試劑

1.1 材料 80只6周齡健康雄性C57BL／6小鼠，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為兩組，分別給予高脂飲食（高脂組）和基礎(chǔ)飼料飲食（對(duì)照組）喂養(yǎng)12w［7］。

1.2 試劑 Harris蘇木精液、RabbitAnti－TNF－a（bs－0078R）、羊抗小鼠IgG－HRP（二抗）、10×WB洗滌液（KGP109）、異丙醇、蘇木素溶液、異丙醇、二甲苯分析醇（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），EDTA抗原修復(fù)液（天津凱通化學(xué)試劑有限公司），山羊二步法免疫組化測(cè)試試劑盒（PV－9003）（天津凱通化學(xué)試劑有限公司），PBS及枸櫞酸鹽緩沖液（天津凱通化學(xué)試劑有限公司），SDS－PAGE凝膠配制試劑盒（KGP113）、Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒（KGA801）、5×SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液（KGP101）、全蛋白抽提試劑盒（KGP250）（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），IL－6（一抗）（Santa Cruz），免疫組化染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 放射免疫法測(cè)定血清胰島素水平 每組小鼠于實(shí)驗(yàn)前禁食14h，稱其體質(zhì)量，取小鼠尾靜脈血測(cè)定空腹血糖值。同時(shí)取小鼠內(nèi)眥靜脈，用放射免疫法測(cè)定血清胰島素水平。

1.3.2 小鼠胰腺組織情況及胰島β細(xì)胞團(tuán)面積斷頸處死并留取小鼠胰腺標(biāo)本，用10%甲醛溶液固定1d，再?zèng)_洗、脫水、浸染、石蠟包埋、連續(xù)切片（厚度約為4μm），行常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察小鼠胰腺組織情況及胰島β細(xì)胞團(tuán)面積的變化。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)定 TNF－a、IL－6 先將準(zhǔn)備好的小鼠胰腺組織提前固定于多環(huán)甲醛，用石蠟包埋、切片，再進(jìn)行脫蠟、脫水，加入雙氧水消除內(nèi)源性氧化物酶的活性，一般室溫10～30min，沖洗進(jìn)行抗原修復(fù)，將稀釋一抗滴于切片，孵育后沖洗，自然干燥后加入二抗，室溫孵育，用PBS反復(fù)沖洗3次，滴入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，室溫孵育，沖洗，加入顯色劑，顯微鏡下注意觀察并及時(shí)用自來(lái)水沖洗以終止反應(yīng)，最后用自來(lái)水大量沖洗，復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定 TLR4、NF－kB 將小鼠胰腺組織剪碎，充分研磨后，在低溫下洗滌，震蕩、高速離心后留取上清液，將TEMED放入配置好的分離膠中，加入電泳液進(jìn)行電泳，電泳20min后變?yōu)?00mA恒流電轉(zhuǎn)1h，轉(zhuǎn)膜完成后在5%脫脂奶粉封閉液中常溫下封閉1h，棄去封閉液，加入一抗（山羊抗小鼠抗體）（1∶1000），室溫孵育2h，加入二抗，室溫下慢搖搖床搖蕩2h，充分洗膜、漂洗進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，加入顯影液曝光，顯影，洗像，然后進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間及不同時(shí)間段小鼠體質(zhì)量、血糖及胰島素水平 喂養(yǎng)12w后，高脂飲食成功誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗模型，小鼠體質(zhì)量、空腹血糖逐漸增加，高脂組分別于第14天、第21天高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第84天至最大值，高脂組血清胰島素水平于第3天開(kāi)始增加，至第7天與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），第84天與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

表1 各時(shí)間段分組的體質(zhì)量、血糖及胰島素水平比較（）

表1 各時(shí)間段分組的體質(zhì)量、血糖及胰島素水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05。

組別 體質(zhì)量／g 血糖／（mmol／L） 胰島素水平／（μmol／L）高脂組0d 23.95±0.45 8.45±0.37 7.20±0.803d 24.60±0.51 9.80±0.57 38.55±4.907d 22.75±0.49 9.60±0.70 216.03±8.10＊11d 25.30±0.76 9.90±0.69 106. 35 ±12.90＊14d 29.70 ±0.21＊ 9.40±0.42 81.20±2.45＊21d 28.80 ±0.84＊10.60 ±0.42＊ 55.50±1.50＊42d 28.50 ±0.43＊對(duì)照組0d 23.50±0.52 8.70±0.54 7.90±0.673d 23.91±0.44 8.85±0.73 29.53±7.307d 23.00±0.23 8.90±0.44 31.70±11.5211d 24.78±0.54 9.47±0.35 68.11±9.8014d 27.00±0.45 9.70±0.61 54.12±2.6921d 26.70±0.24 9.30±0.22 35.00±1.9042d 27.40±0.38 9.45±0.47 42.66±4.5011.00 ±0.55＊ 112.74±6.60＊84d 32.31 ±0.51＊15.20 ±0.64＊ 46.16±9.9084d 26.71±0.51 8.91±1.77 31.19±12.60

2.2 胰腺組織TLR4、NF－κB蛋白表達(dá) 高脂飲食喂養(yǎng)后，胰腺組織從第7天以后TLR4、NF－κB蛋白表達(dá)量開(kāi)始增加，到大約第21天時(shí)增到最高值，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），此后又逐漸下降，同時(shí)伴有胰島的特異性的 TNF－α、IL－6高表達(dá)，見(jiàn)表2、圖1、2。

表2 TLR4與NF－κB蛋白表達(dá)

2.3 胰島細(xì)胞 TNF－α、IL－6的表達(dá) 通過(guò)免疫組化法發(fā)現(xiàn)高脂飲食組小鼠胰島細(xì)胞TNF－α和IL－6呈陽(yáng)性表達(dá)，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－6僅著色于胰島細(xì)胞，在胰腺其他部位未見(jiàn)著色（圖3、4）。

圖1 胰腺組織TLR4蛋白隨喂養(yǎng)天數(shù)的變化

圖2 胰腺組織NF－κB蛋白隨喂養(yǎng)天數(shù)的變化

圖3 胰島TNF－a陽(yáng)性

圖4 胰島IL－6陽(yáng)性

2.4 胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示：0～5d胰島大小不等，分布均勻，形狀規(guī)則，界限清楚，均未見(jiàn)炎癥細(xì)胞，無(wú)水腫，胰島細(xì)胞正常，個(gè)別細(xì)胞胞漿紅染，核深染，符合凋亡細(xì)胞特征；第1周～5周胰島增生，其中在第1周呈現(xiàn)體積開(kāi)始增大，分布較彌散，部分胰島輕度充血、腫脹，內(nèi)有少量凋亡細(xì)胞。第5～10周胰島腫脹明顯，胞漿中可見(jiàn)大小不等的脂肪顆粒，凋亡細(xì)胞明顯增多，胰腺小葉間隔可見(jiàn)稀疏網(wǎng)狀膠原纖維沉積。第11周腺泡開(kāi)始萎縮，開(kāi)始節(jié)結(jié)狀纖維化，到第12周體積已明顯縮小。第15周后胰腺小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，胰腺不完全纖維化，脂肪組織浸潤(rùn)（圖5）。

圖5 高脂喂養(yǎng)不同時(shí)間小鼠胰腺組織 （HE×40）

3 討論

隨著人們飲食的多元化和生活方式的改變，不僅代謝綜合征的發(fā)病日漸增多，而且促進(jìn)了代謝綜合征各組分的發(fā)生和發(fā)展，其中長(zhǎng)期高能量攝入導(dǎo)致機(jī)體肥胖與代謝性疾病的發(fā)生有非常密切的關(guān)聯(lián)。肥胖實(shí)際上是一種低度的慢性炎癥狀態(tài)［8］，TLR4在免疫炎癥基因調(diào)節(jié)中起著很重要的作用，它所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路大部分都需要激活NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使NF－κB活化，繼而啟動(dòng)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄及合成等程序，調(diào)節(jié)炎癥因子分泌，如：TNF－α、IL－6等，促進(jìn)各種炎癥因子分泌入血，進(jìn)而發(fā)生全身性低度慢性炎癥反應(yīng)，最終使機(jī)體發(fā)生了胰島素抵抗。

TLR4／NF－κB信號(hào)通路目前被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)中最重要的一條通路，TLRs最早是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，可以直接識(shí)別、結(jié)合某些病原體和其產(chǎn)物所共同擁有的高度保守的特定分子結(jié)構(gòu)（即病原相關(guān)分子模式），還可以對(duì)不同的病原相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合，并引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致釋放大量炎性介質(zhì)［9－10］，TLR4幾乎在所有細(xì)胞表面具有存在，既往研究［11］已明確小鼠胰腺組織確實(shí)表達(dá)了TLR4，本研究通過(guò)免疫組化法觀察發(fā)現(xiàn)IL－6、TNF－α只著色于胰島細(xì)胞，在胰腺其他部分未見(jiàn)著色，考慮可能是IL－6、TNF－α在胰腺組織內(nèi)僅存在于胰島細(xì)胞，并且本研究表明高脂飲食可以誘導(dǎo)TLR4在胰島β細(xì)胞的表達(dá)增高，在自然配體（LPS）作用下，主要有2條信號(hào)通路，1條是髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑，TLR4和LPS相結(jié)合［12］，然后信號(hào)途徑轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，TLR4的胞內(nèi)區(qū)與MyD88的羧基端結(jié)合，通過(guò)激活I(lǐng)L－1來(lái)激活NF－ΚB，最終使大量合成和釋放炎癥因子。另1條是MyD88非依賴途徑，TLR4通過(guò)TRAM作用于TRIF，然后通過(guò)調(diào)節(jié)TRIF活化IKK復(fù)合體，最終導(dǎo)致 NF－κB釋放入核［13］。

目前研究表明胰島素抵抗患者體內(nèi)存在TLR4／NF－κB信號(hào)通路的激活［14］，小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)TNF－α、IL－6的陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)胰島在實(shí)驗(yàn)第11天時(shí)體積增大，在第84天時(shí)體積明顯縮小，這與臨床上2型糖尿病病人胰腺CT形態(tài)變化趨勢(shì)相符［15］，說(shuō)明了胰島細(xì)胞中 TLR4／NF－κB 信號(hào)通路激活與胰島素抵抗密切相關(guān)［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)胰腺組織中TLR4、NF－κB蛋白表達(dá)量、第7天開(kāi)始增加，第21天達(dá)高峰，此后又逐漸下降，同時(shí)伴有胰島的特異性的 TNF－а、IL－6高表達(dá)。HE染色也表明，胰島在第1周呈現(xiàn)體積增大，到第12周體積已明顯縮小。推測(cè)高脂飲食可以使胰腺組織TLR4／NF－κB信號(hào)通路激活，并產(chǎn)生較多的炎癥因子，參與機(jī)體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)，并與胰島素抵抗之間具有相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)了TLR4存在于全身多種組織中，并且TLR4／NF－κB信號(hào)通路與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，也驗(yàn)證了高脂飲食與肥胖、胰島素抵抗之間的關(guān)系，為糖尿病健康教育提供了更有利的依據(jù)，可考慮通過(guò)減少TLR4的表達(dá)或抑制TLR4信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)胰島素抵抗的發(fā)生，為代謝性疾病的治療提供了一個(gè)新的方向。

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