陳 跡， 王建華

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部， 烏魯木齊 830054)

阿苯達唑被廣泛應用于臨床治療鉤蟲病、蛔蟲病、鞭蟲病、蟯蟲病、旋毛蟲病、絳蟲病、囊蟲病等寄生蟲病，臨床療效良好。國內外學者研究證實阿苯達唑也是一種較為有效的治療包蟲病的藥物[1]。但由于阿苯達唑屬于難溶性藥物，口服后腸道吸收差，生物利用度相對較低，治療包蟲病病灶局部藥物濃度低，長期用藥則毒副作用增加[2]，在一定程度上影響了阿苯達唑的抗包蟲的作用。本研究將阿苯達唑制成前體膠束制劑(ZL200610200344.2)，通過增加阿苯達唑的溶解度來提高阿苯達唑的體內吸收，增加其生物利用度，并利用其納米特性使其具有一定的靶向性。阿苯達唑前體膠束在使用前為一無水的均勻混合物,由于使用前不是以膠束形式存在，只在使用或口服時才形成膠束，因而不存在微粒給藥劑型普遍存在的物理穩(wěn)定性問題。阿苯達唑前體膠束水化后的包封率是阿苯達唑前體膠束質量標準中比較重要一項內容。但目前還沒有一種比較公認行之有效的測定前體膠束水化后的包封率方法，本研究采用葡聚糖凝膠過濾法分離膠束與游離藥物，使用HPLC法測定阿苯達唑前體膠束的包封率，獲得了較好效果，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試劑UV-2550島津紫外可見分光光度計(日本)，BP211D Sarturius電子天平(美國)，Waters Alliance2695/2487高效液相色譜系統(tǒng)(美國)，電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，高速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。阿苯達唑前體膠束(實驗室自制批號：060530-1、060530-2、060530-3)，阿苯達唑原料藥(廣西桂林制藥廠，批號：20040301)，阿苯達就唑標準品 (中國藥品生物制品檢定所，批號：100373-200301)，sephdexG-50(中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司，粒度100～300 μm)，硝酸鉀、冰乙酸、無水乙醇、三乙胺、磷酸均為分析醇，甲醇、乙腈均為色譜醇，水為重蒸餾水。

2實驗方法

2.1含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱ODS C18柱(150 mm×3.9 mm,5 μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶三乙胺-磷酸緩沖液(24∶20∶56)，檢測波長295 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL。

2.1.2 三乙胺-磷酸緩沖液的配制 精密吸取三乙胺35.68 mL，加入1 600 mL重蒸水，用磷酸調節(jié)pH值至3.0，置2 000 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，備用。

2.1.3 貯備液的配制 精密稱取阿苯達唑標準品4 mg置2 mL 容量瓶中，加入冰乙酸溶解，用甲醇稀釋至刻度，得到2 mg/mL的貯備液。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密吸取阿苯達唑貯備液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制濃度為4、8、12、16、20 μg/mL系列標準液，分別進樣，記錄色譜峰面積，以峰面積對濃度回歸，得回歸方程：A=48 259C+1 249.3，r2=0.999 8，線性范圍：4～20 μg/mL，4、12、20 μg/mL的RSD值分別為3.9%、0.85%、2.5%(n=5)。

2.1.5 回收率試驗 按處方劑量配制空白前體膠束，精密稱取樣品量的空白前體膠束于10 mL容量瓶中，加冰乙酸溶解，加甲醇稀釋至刻度，再吸取0.1 mL溶液置10 mL容量瓶中，分別加入0.02、0.06、0.1 mL貯備液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得4、12 、20 μg/mL的含輔料標準液，分別進樣20 μL，測峰面積，代入標準曲線換算成實際測定濃度，計算回收率，結果回收率分別為95.75%、98.11%、97.62%，RSD分別為3.27%、0.30%、1.49%(n=5)。

2.2阿苯達唑前體膠束包封率的測定

2.2.1 葡聚糖凝膠的洗脫曲線測定 取12 h被溶脹的sephdexG-50裝柱10 cm，上樣量為0.5 mL，流速為1 mL/min,用水洗脫。以1 mL為1個流份，收集前20 mL，共計20個流份。從收集的樣品中分別吸取0.5 mL加1 mL冰醋酸再加3 mL甲醇稀釋。采用HPLC法測定其含量，繪制阿苯達唑膠束洗脫曲線，見圖1。

圖1 阿苯達唑膠束洗脫曲線

2.2.2 阿苯達唑膠束溶液、阿苯達唑水飽和溶液通過葡聚糖凝膠的情況比較 分別配制含有相同含量的阿苯達唑膠束水化溶液、阿苯達唑水溶液。分別吸取0.5 mL上柱(高度為10 cm)，用水洗脫，流速為1 mL/min。以1 mL流份為1個點，收集前15 mL。然后從每一份中吸取0.2 mL加1 mL冰醋酸加3 mL甲醇稀釋，采用HPLC法測定其含量。

由于阿苯達唑前體膠束水化溶液中含有包裹藥物的膠束、以分子形式存在的游離的阿苯達唑 以及可能析出的阿苯達唑顆粒，而阿苯達唑水溶液中含有分子形式存在的游離的阿苯達唑以及阿苯達唑顆粒。由阿苯達唑前體膠束水化溶液、阿苯達唑水溶液洗脫曲線可以看出阿苯達唑水溶液中游離的阿苯達唑被葡聚糖凝膠吸附，阿苯達唑顆粒被葡聚糖凝膠阻擋都無法通過葡聚糖凝膠柱，洗脫曲線基本為1條直線。而阿苯達唑前體膠束水化溶液中的阿苯達唑膠束可以通過葡聚糖凝膠柱，在前10 mL流份就可以基本洗脫完全，阿苯達唑膠束和游離的阿苯達唑得到很好分離(圖2)。

2.2.3 阿苯達唑前體膠束包封率的測定方法的確定 根據以上實驗初步確定葡聚糖凝膠法測定阿苯達唑前體膠束方法為：稱取適量阿苯達唑前體膠束于100 mL容量瓶中，配制阿苯達唑濃度為0.05 mg/mL水化液作為樣品，取水化液0.1 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，采用HPLC法測定其含量，計算濃度C0。另取0.5 mL水化液樣品上柱，用水洗脫，流速控制為3 mL/min;接取10 mL洗脫液，取2 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，采用HPLC法測定其含量,計算濃度C1，按公式包封率 (%)= (經柱分離的膠束含藥量/總藥量)×100%計算包封率，即包封率(%)=(C1/C0)×100%。

圖2 阿苯達唑洗脫曲線

2.2.4 阿苯達唑前體膠束包封率測定 按“2.2.3”項下方法測定3批前體膠束(060530-1、 060530-2、060530-3)的包封率，結果包封率為76.38%～81.08%， RSD=6.81%，回收率為(92.23±3.57)%，見表1。

表1 阿苯達唑前體膠束水化后的包封率(n=3)

2.3包封率測定方法的回收率測定稱取適量阿苯達唑前體膠束于100 mL容量瓶中，配制阿苯達唑濃度為0.05 mg/mL水化液作為樣品，取0.5 mL水化液樣品上柱，用水洗脫，流速控制為1 mL/min;接取10 mL洗脫液，作為去除了游離藥物的膠束，精密吸取2 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，用HPLC來測定其含量,計算濃度C1。另取洗脫液(即去除了游離藥物的膠束)2 mL上柱，用水洗脫，流速控制為1 mL/min;接取10 mL洗脫液，從中精密吸取2 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，用HPLC來測定其含量,計算濃度C2。計算回收率/%=(C2/C1)×100%，實驗結果見表2。

表2 方法回收率(%， n=3)

3討論

目前關于包封率測定方法很多，主要有凝膠過濾法[3]、透析法[4]、超速離心法[5]、超濾法[6]及離子交換樹脂法[7]等?？紤]到阿苯達唑前體膠束水化液中游離藥物以微粒形式存在，超速離心法和超濾法在超速離心過程中會使游離藥物和膠束同時沉淀出來，分離不開。同時采用離心法測定阿苯達唑前體膠束的包封率，離心法測定的包封率的結果較葡聚糖凝膠過濾法偏高，也驗證了這種推測。若用透析法進行測定，由于在大量透析液中膠束的結構可能發(fā)生改變，導致藥物的泄漏，從而影響包封率。高曉黎等[3]研究顯示，粒徑為100～300 μm的Sephadex G-50最適于脂質體包封率的測定。本研究前期預實驗采用100～300 μm 的Sephadex G-50及粒徑較小的Sephadex G-20葡聚糖凝膠將游離阿苯達唑和阿苯達唑膠束分離，Sephadex G-50的分離效果較佳，再采用HPLC法測定阿苯達唑前體膠束的包封率可以有效去除輔料的干擾，方法可行，重復性較好，結果準確,可以作為阿苯達唑前體膠束質量標準控制的辦法。

在實驗過程中，洗脫曲線上僅明顯有1個峰，此峰為阿苯達唑膠束峰。游離藥物被葡聚糖凝膠吸附，較難被洗脫下來。所以葡聚糖凝膠在使用3～5次后就該更換，否則對實驗結果會產生影響。

參考文獻:

[1] Davis A,Pawlowskizs DH. Multicentre clinical trials of benzimidazolecarbamates in human echinococcosis[J].Bull World Health Organiza,1986，64(3):383-388.

[2] 王建華，溫浩.阿苯達唑的體內過程和劑型研究進展[J].中國寄生蟲病防治雜志,2002,15(3):187-189.

[3] 高曉黎,季興梅. 葡聚糖凝膠柱色譜法測定脂質體包封率的條件篩選[J]. 中國藥學雜志,2003,38(7):515-517.

[4] 馬晶, 鄧樹海.順鉑前體脂質體的制備及包封率測定[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2006,26(4):416-418.

[5] 楊繼紅, 蔣學華, 楊俊毅. HPLC測定葛根素長循環(huán)脂質體中葛根素的含量和包封率[J]. 華西藥學雜志, 2006, 21(1):66-68.

[6] 雷國峰, 陳琳, 鄧英杰. 超濾法-HPLC法測定燈盞花素脂質體包封率[J]. 沈陽藥科大學學報,2006,23(4):237-239.

[7] 趙研, 于彬, 鄧意輝. 主動載藥法制備硫酸長春新堿脂質體及其包封率的測定[J]. 中國藥學雜志,2005,40(20):1559-1562.