黃思語， 阿爾孜古麗·吐爾遜， 鄧彥超， 陳 艷,3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所； 3新疆食管癌研究所；4新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 烏魯木齊 830054)

食管癌是發(fā)生在食管黏膜層的惡性腫瘤，占所有腫瘤的2%，是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。新疆是我國食管癌高發(fā)區(qū)，以哈薩克族(以下簡稱哈族)人群死亡率最高(88.7/10萬)，遠(yuǎn)高于該地區(qū)其他民族(22.3/10萬)[2]，哈族食管癌的病死率(33.90/10萬)比其他少數(shù)民族高2～31倍，比全國平均病死率(14.59/10萬)高2.3倍[3-4]。關(guān)于正常食管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步發(fā)展成食管癌的相關(guān)研究[5-6]逐漸受到了大家的重視。而成功獲取體外培養(yǎng)的正常食管上皮細(xì)胞是研究食管上皮細(xì)胞增殖、分化及惡性轉(zhuǎn)化的必要條件。國內(nèi)外目前沒有可供研究的哈族食管正常上皮細(xì)胞株。體外培養(yǎng)正常食管上皮細(xì)胞的步驟復(fù)雜，嚴(yán)重制約了后續(xù)的研究工作。本研究采用酶消化法并綜合國內(nèi)外關(guān)于正常食管上皮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈族食管正常上皮細(xì)胞。旨在探討一種更簡便、細(xì)胞純度更高的培養(yǎng)方法，為進(jìn)行哈族食管正常上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究提供可靠的工具。

1 材料與方法

1.1實驗儀器和材料人正常食管上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基EpiCM-2(美國ScienCell公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，0.25%Dispase Ⅱ酶(瑞士Roche公司)，0.25%胰蛋白酶，0.05%胰蛋白酶/0.03%EDTA，雙抗(美國Hyclone公司)，DMSO(美國Sigma公司)，鼠抗人廣譜角蛋白抗體(博士德生物有限公司)，二步法免疫組化檢測試劑盒(中杉金橋公司)，DAB試劑盒(中杉金橋公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2研究對象選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年12月-2013年6月共6例哈族食管癌患者正常食管標(biāo)本(手術(shù)后3 h以內(nèi))，年齡55～75歲，取材前經(jīng)患者及家屬知情同意。肉眼選取距腫瘤邊緣 3 cm 以外的食管，長約2 cm。食管取下后迅速放入含有200 U/mL 青霉素、200 μg/mL 鏈霉素的冷的1640培養(yǎng)基中，帶回實驗室。

1.3食管上皮細(xì)胞的分離、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)在超凈臺內(nèi)取出食管標(biāo)本，放入含有15 mL 0.05%醋酸氯已定溶液的無菌離心管中，浸泡3～5 min。取出食管標(biāo)本，放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)用含有200 U/mL青霉素、200 μg/mL 鏈霉素的冷的PBS沖洗至無凝血塊為止，剪去食管兩端的壞死組織。用無菌組織剪沿食管長軸剪開食管并展平，交替使用0.05% 醋酸氯已定溶液和含有200 U/mL 青霉素、200 μg/mL 鏈霉素的 PBS溶液沖洗食管黏膜3次，每次1 min。用無菌眼科剪和眼科鑷將食管黏膜下的肌肉等組織去除，置于含有0.25% DispaseⅡ的無菌青霉素小瓶中，4℃ 消化過夜。次日用無菌眼科鑷將食管黏膜層輕輕撕下，放入含有5 mL 0.25%胰蛋白酶和小磁力攪拌器轉(zhuǎn)子的無菌青霉素小瓶中，37℃ 攪拌消化20～30 min，加入等體積含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化。經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，收集過濾后的細(xì)胞懸液，室溫下1 000 r/ min離心5 min，棄上清，用 PBS洗滌細(xì)胞1 次。加入EpiCM-2無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁牢固后換液，以后每2～3天換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90% 融合時按1∶2～1∶3傳代。傳代時吸出舊培養(yǎng)液，3 mL PBS 洗滌2次，加入1 mL 0.05%胰酶/0.03% EDTA 洗滌1次后吸出，再加入2 mL 0.05%胰酶/0.03% EDTA 37 ℃ 消化1～2 min，輕輕拍打培養(yǎng)瓶底部使大部分細(xì)胞脫壁，加入等體積含血清的1640 培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打瓶壁使細(xì)胞脫落，取細(xì)胞懸液，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞1次，EpiCM-2重懸細(xì)胞，接種到新的培養(yǎng)瓶中。凍存細(xì)胞時，將細(xì)胞消化離心后用預(yù)冷的1 mL凍存液(含85% EpiCM-2培養(yǎng)基、10% FBS和5% DMSO)懸浮細(xì)胞，收集于2 mL凍存管中，4℃ 20 min，-20℃ 40 min，-80℃過夜，液氮中長期保存。

1.4原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 定期在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。

1.4.2 細(xì)胞鑒定 取第2代細(xì)胞爬片培養(yǎng)，經(jīng)3～5 d細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后，吸出舊培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，晾干爬片。95%乙醇室溫下固定生長于爬片表面的細(xì)胞30 min，PBS洗滌2次。加入鼠抗人廣譜角蛋白單克隆抗體，4℃ 孵育過夜。PBS洗滌3次，每次1 min。滴加二抗，37℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次，每次1 min。DAB顯色后觀察。

2 結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察采用 0.25% DispaseⅡ和 0.25%胰蛋白酶聯(lián)合消化法成功獲得哈族食管正常上皮細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞2～3 d后貼壁牢固，可首次換液。鏡下觀察細(xì)胞輪廓清晰，邊界清楚，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞折光性好，胞核較大，內(nèi)含1～3個核仁。首次培養(yǎng)8～10 d細(xì)胞生長融合可達(dá)80%～90%，細(xì)胞排列緊密，呈“鋪路石”狀(圖1、2)。傳代后的上皮細(xì)胞3～5 d 后即可融合，可再次傳代。3代之前培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小均一；3代之后細(xì)胞隨傳代次數(shù)增加細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒，有巨型細(xì)胞出現(xiàn)，占總細(xì)胞的5%～10%(圖3)。4代之后培養(yǎng)細(xì)胞折光性減弱，核內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞分裂像減少，貼壁能力下降，個別細(xì)胞因不能貼壁而漂浮在培養(yǎng)基中，出現(xiàn)“細(xì)胞拉網(wǎng)”現(xiàn)象(圖4)。

2.2培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定細(xì)胞鑒定采用免疫組化的方法，細(xì)胞角蛋白免疫組化染色顯示細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，說明所培養(yǎng)的原代細(xì)胞是上皮細(xì)胞來源，證明細(xì)胞為食管上皮細(xì)胞(圖5、6)。

圖1培養(yǎng)7d的原代哈族正常食管上皮細(xì)胞，呈“鋪路石”狀排列(×200)圖2培養(yǎng)7d的原代哈族正常食管上皮細(xì)胞，鑲嵌排列，邊界清晰(×400)圖33代后細(xì)胞變大，折光性減弱，出現(xiàn)巨型細(xì)胞(×200)

圖44代后細(xì)胞分裂相減少，細(xì)胞界限不清，出現(xiàn)“細(xì)胞拉網(wǎng)”現(xiàn)象(×200)圖5原代培養(yǎng)的哈族正常食管上皮細(xì)胞角蛋白表達(dá)陽性(×200)圖6免疫組化法將細(xì)胞胞質(zhì)染成棕黃色(×400)

3 討論

目前國內(nèi)外報道的培養(yǎng)人食管正常上皮細(xì)胞的方法多種多樣，本研究根據(jù)國內(nèi)外有關(guān)人食管正常上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，綜合各種方法的優(yōu)勢成功培養(yǎng)出哈族食管正常上皮細(xì)胞。本實驗的標(biāo)本來源為年齡55～75歲哈族食管癌患者，共計6例，其中成功培養(yǎng)出食管正常上皮細(xì)胞4例，污染2例。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，成功培養(yǎng)出食管上皮細(xì)胞的關(guān)鍵在于對標(biāo)本的消毒。因食管與外界相通且食管癌患者的自身抵抗能力較低，食道內(nèi)容易滋生霉菌及細(xì)菌等，若在細(xì)胞培養(yǎng)之前沒有對食管標(biāo)本進(jìn)行徹底的消毒，后期培養(yǎng)的細(xì)胞極易受到污染。因此，在培養(yǎng)細(xì)胞之前參照文獻(xiàn)[7-8]對食管標(biāo)本進(jìn)行消毒，采用0.05%醋酸氯已定溶液浸泡及反復(fù)沖洗食管的方法，此法培養(yǎng)的4例食管標(biāo)本均未受到污染，而未消毒的2例分別被霉菌和葡萄球菌污染。值得注意的是，在用醋酸氯已定溶液消毒的時候，對標(biāo)本的浸泡時間不宜過長，應(yīng)在1～1.5min為宜，否則浸泡時間過長正常的食管上皮細(xì)胞也會死亡。

體外培養(yǎng)人食管上皮細(xì)胞的方法主要分為組織塊培養(yǎng)法和酶消化法。組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)出的細(xì)胞容易受到成纖維細(xì)胞的污染[7]，導(dǎo)致培養(yǎng)的上皮細(xì)胞不純，并且培養(yǎng)細(xì)胞的時間較長[8-10]。酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞的方法相對比較簡單，更容易操作，培養(yǎng)出細(xì)胞的時間較組織塊法短并且獲得的食管上皮細(xì)胞純度較高[11-13]。本實驗采用中性蛋白酶(DispaseⅡ)和胰蛋白酶聯(lián)合消化法培養(yǎng)哈族正常食管上皮細(xì)胞，培養(yǎng)出的細(xì)胞經(jīng)鑒定上皮細(xì)胞來源大于95%，說明此法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞純度較高。

本研究建立了哈族食管正常上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)的方法，使用中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化法成功獲取單個食管上皮細(xì)胞，方法簡單，容易操作。培養(yǎng)的細(xì)胞純度較高，細(xì)胞數(shù)量較多，使用EpiCM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞可滿足細(xì)胞連續(xù)傳代的需要，可以為后續(xù)試驗提供工具。

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