吳專麗 冶鵬輝 周雪雁

摘 要 為探究阿苯達(dá)唑?qū)w外培養(yǎng)的豬帶絳蟲不同部位（頭部、頸部、節(jié)片）的糖原作用效果，分別制備濃度為0 μmol·mL-1、10 μmol·mL-1、20 μmol·mL-1、30 μmol·mL-1、40 μmol·mL-1的阿苯達(dá)唑溶液，并加入等量含營(yíng)養(yǎng)液的生理鹽水，在此條件下各培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，最后采用石蠟切片法制片、染色，觀察豬帶絳蟲糖原在頭部、頸部、節(jié)片的情況。結(jié)果表明：阿苯達(dá)?破壞豬帶絳蟲的最佳濃度為20 μmol·mL-1，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，糖原可被完全破壞。此外，頸部糖原減少最明顯，說明阿苯達(dá)?對(duì)頸部糖原破壞最大。

關(guān)鍵詞 阿苯達(dá)唑;豬帶絳蟲;糖原

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.17.074

豬帶絳蟲病或稱為囊尾蚴病綜合征是一種由人類寄生蟲引起的人畜共患病。豬囊尾蚴主要存活在豬的橫紋肌內(nèi)，尤其是肩部、頸部、腹部、腿部的肌肉中寄生的情況較為多見，同時(shí)還會(huì)在心臟、大腦等部位寄生，成蟲豬帶絳蟲則寄生在人體小腸內(nèi)，蟲體為白色半透明帶狀[1]。豬帶絳蟲病是一種容易被忽視的疾病，給非洲、亞洲和拉丁美洲的發(fā)展中國(guó)家?guī)砹溯^為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?；诖?，探究阿苯達(dá)唑?qū)ωi帶絳蟲糖原的作用，以便于更好治療豬帶絳蟲病。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米豬肉，生理鹽水，阿苯達(dá)唑，Hanks培養(yǎng)液，小牛血清，鏈霉素，青霉素，石蠟，糖原PAS染色劑（過碘酸、20 g·L-1甲基綠、醋酸鈉-吡啶、Schiff氏液等），75%乙醇溶液，石蠟。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;顯微鏡，奧林巴斯CX21;石蠟切片機(jī)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

從各肉制品加工廠、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)挑選疑似含有囊尾蚴的新鮮肉品，此肉一般顏色較暗淡不鮮亮，瘦肉中呈黃豆樣大小、乳白色半透明水泡[2]。購入后挑選充滿透明囊液的大小類似、生長(zhǎng)狀況類似的囊尾蚴，以保證將實(shí)驗(yàn)過程中因絳蟲個(gè)體差異引起的實(shí)驗(yàn)誤差降到最低。

將收集到的豬囊尾蚴置于37 ℃生理鹽水中輕輕地反復(fù)清理3～4次，然后用含40%豬膽汁的生理鹽水置于42 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至絳蟲蟲體頭頸部孵出。然后選擇生命力強(qiáng)且形態(tài)大小類似的蟲體在37 ℃的生理鹽水中漂洗2～3次。

配取濃度分別為0 μmol·mL-1、10 μmol·mL-1、20 μmol·mL-1、30 μmol·mL-1、40 μmol·mL-1的阿苯達(dá)唑溶液5 mL，分別置于5個(gè)直徑為15 cm的平皿中，各加入2條豬帶絳蟲，再均加入Hanks培養(yǎng)液20 mL、小牛血清10 mL，為防止細(xì)菌對(duì)豬帶絳蟲生長(zhǎng)造成影響，可在營(yíng)養(yǎng)液中加入100 U·mL-1青霉素以及100 μg·mL-1鏈霉素。標(biāo)號(hào)后置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并每12 h更換一次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，觀察比較不同濃度下各組豬帶絳蟲蟲體頭部、頸部和節(jié)片三部分糖原的情況，并設(shè)置陰性對(duì)照組即用醋酸酐-吡啶消化組織中的糖原。

采用對(duì)糖原影響最小的阿苯達(dá)唑濃度，取四個(gè)直徑為15 cm的平皿各加入3條豬帶絳蟲，再加入Hanks培養(yǎng)液20 mL、小牛血清10 mL，為防止細(xì)菌對(duì)豬帶絳蟲生長(zhǎng)造成影響，可在營(yíng)養(yǎng)液中加入100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素。標(biāo)號(hào)后置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，并每12 h更換一次營(yíng)養(yǎng)液，達(dá)到各自培養(yǎng)時(shí)間后，觀察各組豬帶絳蟲蟲體各部分糖原的情況，并設(shè)置無阿苯達(dá)唑培養(yǎng)的對(duì)照組觀察此組絳蟲各部分糖原情況。

取出各組處理的囊尾蚴，在普通固定液中浸泡約10 min后取出，經(jīng)脫水透明處理后開始浸蠟包埋，使用切片機(jī)切成厚度約20 μm的切片并編號(hào)標(biāo)出頭節(jié)、頸節(jié)、節(jié)片，然后附著于載玻片上烤干，最后進(jìn)行脫蠟，制成切片[3]。進(jìn)而使用PAS染色法進(jìn)行染色[4]，水洗數(shù)次后滴加過碘酸于涂片上，靜置10 min后沖洗2～3次，然后浸入Schiff氏液30 min后取出沖洗，并用20 g·L-1甲基綠復(fù)染15 min即完成染色，鏡下觀察各組絳蟲蟲體各部分糖原變化。為了減少制片染色過程中糖原的損失，用0.5%火棉膠保護(hù)組織[5]，沖洗過程應(yīng)當(dāng)緩慢輕柔或在靜水中漂洗2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度阿苯達(dá)唑?qū)ωi帶絳蟲的影響結(jié)果

不同濃度阿苯達(dá)唑?qū)ωi帶絳蟲的影響結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，10 μmol·mL-1阿苯達(dá)唑?qū)μ窃饔貌粔蛎黠@，且隨阿苯達(dá)唑濃度的增加則對(duì)豬帶絳蟲囊尾蚴中糖原的破壞也增加，且分別觀察各組中頭部、頸部、節(jié)片中糖原情況可發(fā)現(xiàn)，頸部糖原受破壞較嚴(yán)重。當(dāng)無阿苯達(dá)唑作用時(shí)豬帶絳蟲各部分組織胞漿中紅色顆粒均較多且粗大，少部分甚至呈現(xiàn)紫紅色，此外也表現(xiàn)為頸部紅色區(qū)域最多且顏色相對(duì)最深。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿苯達(dá)唑濃度為20 μmol·mL-1、30 μmol·mL-1和40 μmol·mL-1作用的絳蟲組織胞漿中有1個(gè)或2個(gè)紅色顆粒環(huán)，有的則呈現(xiàn)彌漫紅色物，表明這三個(gè)濃度在時(shí)間為48 h內(nèi)的作用效果相似，推測(cè)造成此情況的原因有藥物作用時(shí)間不足導(dǎo)致高濃度阿苯達(dá)唑并未完全發(fā)揮其作用，也可能是因?yàn)榇怂幬飳?duì)豬帶絳蟲的作用已達(dá)到最大。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬帶絳蟲的影響結(jié)果

不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬帶絳蟲的影響結(jié)果見表2。采用20%濃度阿苯達(dá)唑進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明培養(yǎng)24 h和48 h的絳蟲胞漿中有1～2個(gè)紅色大顆?；?0個(gè)以下中等大的顆粒，有的則呈現(xiàn)彌漫狀態(tài)的紅色物，表明糖原含量較少。作用72h者和作用96 h者則無紅色陽性顆粒和淺紅色物質(zhì)存在，表明無糖原存在或偶然造成糖原損失，應(yīng)當(dāng)重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。比較各組豬帶絳蟲頭部、頸部、節(jié)片可發(fā)現(xiàn)，頸部紅色區(qū)域相對(duì)較少，對(duì)照無藥物作用的絳蟲頸部糖原含量較多，可知此處受阿苯達(dá)唑破壞較嚴(yán)重。此外，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，阿苯達(dá)唑?qū)μ窃钠茐淖饔靡布訌?qiáng)直至完全破壞。

3 結(jié)論與討論

阿苯達(dá)?破壞豬帶絳蟲的最佳濃度為20 μmol·mL-1，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)糖原可被完全破壞。此外，頸部糖原減少最明顯，說明阿苯達(dá)?對(duì)頸部糖原破壞最大，推測(cè)造成這一作用特點(diǎn)的原因是頸部為新節(jié)片產(chǎn)生的部位，新陳代謝旺盛，糖原產(chǎn)生較多。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高學(xué)軍，李慶章，劉永潔，等.奧芬達(dá)唑和阿苯達(dá)唑?qū)ωi囊尾蚴作用形態(tài)學(xué)比較觀察[J].中國(guó)獸藥雜志，2004（8）：9-12.

[2] 陳兆浚，牛安歐，周梓林.阿苯達(dá)唑?qū)ωi囊尾蚴糖原作用的觀察[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1988（S1）：114.

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[4] 黃瓊?cè)A.上杭縣豬囊尾蚴病的流行病學(xué)和防治調(diào)查[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2016.

[5] 史大中，劉德山.吡喹酮對(duì)囊尾蚴糖原和堿性磷酸酶作用的觀察[J].蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1983（1）：12-16.

（責(zé)任編輯：劉昀）