郭 瓊， 吳紅紅， 李明遠(yuǎn)， 魏曉麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室， 2附屬中醫(yī)醫(yī)院幸福路社區(qū)醫(yī)院內(nèi)科， 烏魯木齊 830000;3四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室， 成都 610041; 4新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室, 烏魯木齊 830011)

抗菌肽是生物體抵御外界病原生物侵襲而產(chǎn)生的一種小分子多肽，具有廣譜的抗菌活性，并有抗真菌、病毒等生物學(xué)活性，而對正常細(xì)胞無傷害，是機體在長期進(jìn)化過程中保留下來的一種古老的宿主防御機制[1]。哺乳動物體內(nèi)的抗菌肽主要是防御素(defensins)，作為生物體內(nèi)天然防御系統(tǒng)的重要組成部分，連接天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，對機體抵抗外界生物感染起著關(guān)鍵的作用[2]。此外，許多科學(xué)研究表明防御素也具有抗腫瘤效應(yīng)[3-4]，但其機制尚不完全清楚?，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的500多種抗菌肽中，有18種抗菌肽的抗腫瘤活性已得到實驗證實。宮頸癌是倍受世界關(guān)注的女性高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下，在全球位列女性惡性腫瘤的第二位，宮頸癌的防治成為保護(hù)婦女兒童健康的全球共同關(guān)注問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和腫瘤發(fā)生分子機制的深入研究，生物治療已成為腫瘤綜合治療的第4種模式，并具有廣泛的應(yīng)用前景。本課題前期研究工作中，采用pcDNA3.1(+)/mBD2和具有明確穿膜功能的小鼠IgGΚ鏈的信號肽基因替代mBD2信號肽基因，形成IgGΚ鏈、成熟肽2個部分的重組防御素分子質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/rmBD2轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，制備了宮頸癌細(xì)胞瘤苗SiHa/M、SiHa/R[5-6]。本研究對細(xì)胞的特性進(jìn)行了體外研究，為進(jìn)一步觀察其體內(nèi)抗宮頸癌效果奠定基礎(chǔ)，同時為將防御素應(yīng)用于腫瘤免疫治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細(xì)胞株及質(zhì)粒 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/mBD2質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)/rmBD2質(zhì)粒宮頸癌細(xì)胞株SiHa/M、SiHa/R本室保存，宮頸癌SiHa細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心免疫學(xué)教研室魏大鵬老師惠贈，用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、10%胎牛血清在37℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 RPMI1640、胎牛血清(GIBCO公司)，PVDF膜(invitrogen公司)，5 %脫脂奶粉(invitrogen公司)，羊抗鼠mBD2抗體 (Santa cruz公司)，兔抗羊IgG抗體、DAB(Fermentas 公司)，Annexin Ⅴ、PI、Rnase酶(Bioscience公司)，TUNEL試劑盒(Roche公司)，細(xì)胞活力分析采用BECKMAN VICELLA AUTO 100/240進(jìn)行測定。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞裂解上清mBD2蛋白表達(dá) 收集并裂解各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE (Tricine sodiumdodecyl sulfatepolyacry lamidegele lectrophoresis , Tricine-SDS- PAGE )電泳，分離蛋白,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯( polyvinyli denedifluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜后，分別用1∶100稀釋羊抗鼠mBD2抗體孵育2 h，TBST洗膜3次(10 min /次)，再用1∶1 000稀釋兔抗羊IgG抗體孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min /次)，DAB顯色檢測結(jié)果。

1.2.2 細(xì)胞活力測定 取對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，分別接種于12塊6孔板中，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔。在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、5%CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后于每天同一時間分別消化3組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸后加入測量杯中，于細(xì)胞活力分析儀上進(jìn)行細(xì)胞活力測定，并繪制細(xì)胞活力曲線。

1.2.3 PI、Annexin Ⅴ雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞用胰酶消化離心收集細(xì)胞， PBS洗滌并用臺盼藍(lán)染色測定活細(xì)胞百分比，用PBS將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106個/mL。分別用含Rnase的Annexin Ⅴ染色液、PI避光染色各30 min，流式細(xì)胞儀檢測并記錄實驗結(jié)果。

1.2.4 TUNEL法測定細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105個/mL于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿60%左右，用冰預(yù)冷的95%乙醇于-20℃固定20 min，室溫中晾干；依次在100%、95%、70%的乙醇依次脫水2 min，并采用3%H2O2甲醇溶液室溫30 min，0.1%Triton X-100于4℃ 2 min，滴加正常羊血清，室溫孵育10 min，滴加TdT 及FITC 標(biāo)記的核苷酸混合反應(yīng)液50 μL，37℃ 60 min后終止標(biāo)記反應(yīng)(1×TdT Stop Buffer)，并采用DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡觀察凋亡結(jié)果并計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)按照在顯微鏡高倍鏡下(×400)觀察5個視野，每個視野數(shù)100個細(xì)胞，計算凋亡細(xì)胞所占百分比，即為凋亡指數(shù)(AI)。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞裂解上清Westernblot分析結(jié)果顯示，SiHa/M、SiHa/R組在4～6 Ku區(qū)域出現(xiàn)目的條帶，而SiHa組無目的條帶(圖1)。

圖1 細(xì)胞裂解上清的Western blot分析

2.2mBD2對細(xì)胞活力的影響第1天SiHa/M、SiHa/R組與SiHa組比較，細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.091)；第2、3天SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞活力明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)；第4、5天3組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.374)(圖2)。

2.3mBD2對細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 Annexin Ⅴ聯(lián)合PI檢測結(jié)果 結(jié)果顯示SiHa/M、SiHa/R及SiHa組Annexin Ⅴ+/PI+雙陽性細(xì)胞的百分率分別為2.4%、2.3%、2.3%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.743)；Annexin Ⅴ+/PI-細(xì)胞分別為0.9%、1.2%、1.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

*P<0.05，compared with SiHa at the same time圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活力分析結(jié)果

2.3.2 TUNEL檢測結(jié)果 細(xì)胞大小形態(tài)不一，可見凋亡細(xì)胞胞核固縮濃染，核質(zhì)致密，出現(xiàn)核邊緣化，呈半月形；正常細(xì)胞胞核相對疏松，無核濃染現(xiàn)象(圖4～6)。SiHa/M、SiHa/R組凋亡細(xì)胞發(fā)生率較高，分別為(40.6±4.67)%、(30.2±3.19)%，而SiHa組只有(7.4±1.94)%，SiHa/M、SiHa/R組凋亡細(xì)胞發(fā)生率明顯高于SiHa組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)；SiHa/M組與SiHa/R組比較，SiHa/M組凋亡發(fā)生率高于SiHa/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。

A: SiHa組 B: SiHa/M組 C: SiHa/R組

圖3AnnexinⅤ檢測各組細(xì)胞的凋亡結(jié)果

A: DAPI 染色 B: FITC染色 C: A、B重疊結(jié)果

圖4SiHa/M凋亡結(jié)果(×600)

A: DAPI 染色 B: FITC染色 C: A、B重疊結(jié)果

圖5SiHa/R凋亡結(jié)果(×600)

A: DAPI 染色 B: FITC染色 C: A、B重疊結(jié)果

圖6SiHa凋亡結(jié)果(×600)

3 討論

機體對“非己”的免疫反應(yīng)需要天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用。天然免疫反應(yīng)不僅提供了抵抗微生物的第一道防線，同時也包含指導(dǎo)獲得性免疫所必需的“危險信號”。防御素是宿主執(zhí)行免疫防御能力的細(xì)胞所分泌的、具有殺微生物活性和細(xì)胞毒性的小分子多肽，提供直接、即刻的抗微生物效應(yīng)以保護(hù)宿主免受入侵病原微生物損害，是固有免疫中重要的效應(yīng)分子和調(diào)節(jié)分子，廣泛用于抗菌、抗病毒等作用的研究。自首次報道防御素能裂解腫瘤細(xì)胞之后，不斷有研究提示防御素與腫瘤免疫有關(guān)[7-9]。研究表明，mBD2可與細(xì)胞表面CCR6受體結(jié)合，呈劑量依賴性的誘導(dǎo)未成熟樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)CD34+祖細(xì)胞源性DCs的移動[10]。進(jìn)一步的研究顯示，mBD2可與Toll樣受體4 (toll like receptor，TLR)結(jié)合，誘導(dǎo)骨髓源性DCs成熟[11]。此外，由于腫瘤細(xì)胞膜表面特性發(fā)生改變而使得防御素能夠與之結(jié)合并產(chǎn)生抗瘤作用也可能是防御素抗腫瘤的機制之一。防御素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用遠(yuǎn)大于非腫瘤細(xì)胞，但這種選擇性殺傷的機制目前尚不清楚[12]。

本研究通過細(xì)胞活力測定，顯示SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞在貼壁后2～3 d細(xì)胞活性明顯低于正常SiHa細(xì)胞。隨后，隨著細(xì)胞數(shù)目增加，培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)消耗增加，細(xì)胞代謝產(chǎn)物堆積，細(xì)胞活性開始下降，提示mBD2蛋白對細(xì)胞活力有一定的抑制作用。這可能與防御素作用于細(xì)胞線粒體從而影響腫瘤細(xì)胞呼吸、導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂、細(xì)胞活力下降有關(guān)。SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞活力比較，SiHa/M始終低于SiHa/R組，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明2種蛋白信號肽分子對蛋白活性影響不大。

本研究采用Annexin V 聯(lián)合PI法和TUNEL 2種方法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡情況。2種方法分別檢測凋亡發(fā)生的不同時相，反映誘發(fā)凋亡的不同機制。采用Annexin Ⅴ檢測方法觀察細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)3組細(xì)胞凋亡指數(shù)無明顯差別；采用TUNEL染色，結(jié)果顯示SiHa/M、SiHa/R組凋亡細(xì)胞發(fā)生率較高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；SiHa/M組與SiHa/R組比較，SiHa/M組凋亡發(fā)生率高于SiHa/R組。

綜上所述，可以認(rèn)為mBD2蛋白所誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞凋亡主要以腫瘤細(xì)胞DNA出現(xiàn)斷裂損傷為主，這與Hariton等[13]研究結(jié)果一致。而由于細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致PS外翻通過Annexin Ⅴ檢測方法未能得到驗證，可能是由于早期凋亡所產(chǎn)生的PS外翻過程較為短暫，采用Annexin Ⅴ未能捕捉到早期凋亡信號，故檢測陽性率較低。由于SiHa/M與SiHa/R的主要區(qū)別在于兩者所轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中插入序列信號肽區(qū)域基因有所不同，是否信號肽及其調(diào)控區(qū)序列在成熟肽形成中具有一定的調(diào)節(jié)功能，從而對成熟肽功能產(chǎn)生一定影響，還需實驗進(jìn)一步研究證實。

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