張業(yè)貴 龔 鑫 李懷斌

（皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002）

缺血性腦卒中是臨床上常見的急性腦血管病，具有高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，腦缺血致殘的原因，與成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元缺乏再生能力、損傷后易形成膠質(zhì)瘢痕有關(guān)。因此，近年來，與神經(jīng)再生有關(guān)的神經(jīng)干細(xì)胞，與膠質(zhì)瘢痕形成有關(guān)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞越來越受到人們的重視，成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。針灸在臨床上對(duì)腦缺血有良好的治療作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)參照Longa等［1］，采用線栓法制作大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，通過動(dòng)態(tài)觀察腦缺血再灌注大鼠齒狀回巢蛋白（nestin）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrilliary acidic protein，GFAP）表達(dá)的變化，以及電針對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響，探討電針治療腦梗死的可能機(jī)制。

材料和方法

1.材料、試劑及儀器

成年SD大鼠72只，體重250－300g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（浙）2008－0033。兔抗nestin、兔抗GFAP（北京博奧森公司）及SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），低頻電子脈沖治療儀（G6805－2，上海醫(yī)用電子儀器廠），Olympus顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本），Image－J（National Institute of Health，美國(guó)）圖像分析軟件。

2.造模及分組

采用線栓法建立MCAO再灌注模型，用3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉生效后，將大鼠仰臥固定，去頸部毛，碘伏消毒。沿頸部正中切開皮膚，在右側(cè)肌肉深部分離頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎并剪斷ECA遠(yuǎn)端。暫時(shí)夾閉ICA、CCA，用眼科剪將ECA結(jié)扎處近端剪一小口，從此口插入釣魚線（直徑0.26mm，頭端燒成圓形），經(jīng)ICA插至大腦前動(dòng)脈（ACA），魚線平均插入深度為18.5±0.5mm至微感阻力。結(jié)扎ECA殘端以固定魚線和防止出血，將栓線末端留少許在外。缺血2h后，將栓線拉出至ECA結(jié)扎端進(jìn)行再灌注。造模后大鼠出現(xiàn)患側(cè)Horner綜合征，對(duì)側(cè)不同程度偏癱體征，視為模型成功。假手術(shù)組僅暴露CCA、ECA、ICA，縫合皮膚即可。將造模成功的大鼠隨機(jī)分模型組、電針組，每組再分為3、7、14和21d等4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠，另設(shè)各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組各6只。

3.電針方法

取百會(huì)和大椎穴，用30號(hào)1寸毫針電針，頻率2Hz，強(qiáng)度以大鼠頭部能輕微抖動(dòng)為度。持續(xù)30 min，每天1次，分別治療3d、7d、14d、21d。假手術(shù)組和模型組給予常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

4.行為學(xué)觀察

各組大鼠在處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Longa［1］評(píng)分法。0分：正常；1分：左側(cè)前肢不能完全伸直；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走向左側(cè)傾倒；4分：不能自己行走或昏迷。

5.取材和免疫組織化學(xué)染色

用30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開胸腔暴露心臟，穿刺針經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈，先快速灌注100ml生理鹽水，再用4℃1%多聚甲醛300 ml灌注，30min內(nèi)完成。斷頭取腦，于4%多聚甲醛中固定，過夜，常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚5 μm。常規(guī)脫蠟至水，微波熱抗原修復(fù)，一抗nestin、GFAP均選用兔抗人多克隆抗體（北京博奧森公司），稀釋度為1∶100，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗，余步驟相同，按照SABC（武漢博士德公司）試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

6.細(xì)胞計(jì)數(shù)及灰度值測(cè)定

每亞組選取相同冠狀切面的切片各12張（其中每只大鼠選取2張），利用讀數(shù)顯微鏡在10×40倍視野下對(duì)每張切片DG區(qū)域的nestin、GFAP陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用Image－J圖像分析軟件檢測(cè)細(xì)胞平均灰度值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

假手術(shù)組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)未見神經(jīng)功能缺損，評(píng)分均為0分（未列數(shù)據(jù)）；模型組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，3d時(shí)最重，且功能恢復(fù)較慢 （7d、14d，P＞0.05），而電針組在7d、14d、21d時(shí)神經(jīng)功能缺損癥狀明顯改善，評(píng)分和同時(shí)間點(diǎn)模型組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01或P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（n＝6，±s）Table1 Table1Neurologic imparment scores in each group（n＝6，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（n＝6，±s）Table1 Table1Neurologic imparment scores in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較（Compared with model group at the same time）；△P＜0.01，與同組3d比較（Compared with the same group of 3day）

組別（Group）3d 7d 14d 21d模型組（Model Group） 3.17±0.75 2.67±0.52 2.50±0.55 2.17±0.75△電針組（EA Group） 2.83±0.41 1.83±0.75＊△ 1.33±0.52＊＊△ 1.17±0.41＊＊△

2.各組大鼠齒狀回nestin陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值比較

表2、圖1示，在正常大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)，nestin陽性細(xì)胞呈棕黃色，以胞漿著色為主，表達(dá)較弱；模型組nestin的陽性細(xì)胞數(shù)在3d時(shí)開始增加，7d時(shí)數(shù)目最多（P＜0.01），灰度值明顯降低（P＜0.01），14d時(shí)表達(dá)稍有下降，但仍顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），21d時(shí)表達(dá)降低；與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)電針組陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加，灰度值降低 （P＜0.01或P＜0.05）。

表2 各組大鼠齒狀回nestin陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table2 The number of nestin IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

表2 各組大鼠齒狀回nestin陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table2 The number of nestin IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較（Compared with sham operation group at the same time）；△P＜0.05，△△P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較（Compared with model group at the same time）

組別（Group）細(xì)胞數(shù)（個(gè)/400倍視野）（Cell number/×400）平均灰度值（average gray value）3d假手術(shù)組（Sham operation group of 3day）5.50±4.30 183.49±4.06 3d模型組（model group of 3day） 15.67±5.60＊＊ 179.03±3.50 3d電針組（EA group of 3day） 20.75±6.30＊＊△ 172.41±6.73＊＊△△7d假手術(shù)組（Sham operation group of 7day） 5.08±4.01 182.67±3.98 7d模型組（model opertion group of 7day） 21.33±6.51＊＊ 175.04±7.77＊＊7d電針組（EA group of 7day） 29.42±6.56＊＊△△ 155.54±8.68＊＊△△14d假手術(shù)組（Sham operation group of 14day） 6.42±4.76 183.62±4.08 14d模型組（model opertion group of 21day） 17.00±6.93＊＊ 177.23±5.85＊14d電針組（EA group of 14day） 22.17±7.17＊＊△ 171.42±5.81＊＊△21d假手術(shù)組（Sham operation group of 21day） 5.83±5.01 182.25±5.28 21d模型組（model opertion group of 21day） 8.83±3.35 179.64±6.91 21d電針組（EA group of 21day） 14.33±6.64＊＊△ 174.40±6.12＊＊△

3.各組大鼠齒狀回GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值比較

各組大鼠齒狀回均有GFAP陽性表達(dá)，多呈棕褐色，以胞漿和突起著色為主，假手術(shù)組胞體較小，突起較短，模型組和電針組胞體較大，突起較長(zhǎng)，染色較深。假手術(shù)組GFAP的表達(dá)較少；模型組各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組均明顯增加，灰度值降低（P＜0.05或P＜0.01），3d時(shí)表達(dá)開始增高，14 d達(dá)高峰，21d有所下降；與模型組比較，電針組在7d、14d時(shí)GFAP的表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低，灰度值增加（P＜0.05或P＜0.01），但陽性細(xì)胞數(shù)變化不明顯（P＞0.05），電針21d時(shí)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)強(qiáng)度均顯著下降（P＜0.01）（表3、圖2）。

表3 各組大鼠齒狀回GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table3 The number of nestin GFAP IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

表3 各組大鼠齒狀回GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table3 The number of nestin GFAP IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較（Compared with sham operation group at the same time）；△P＜0.05，△△P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較（Compared with model group at the same time）

組別（Group）細(xì)胞數(shù)（個(gè)/400倍視野）（Cell number/×400）平均灰度值（average gray value）3d假手術(shù)組（Sham operation group of 3day）17.25±4.11 184.27±8.92 3d模型組（model group of 3day） 24.08±5.60＊＊ 175.16±6.43＊3d電針組（EA group of 3day） 25.00±5.83＊＊ 177.55±8.49 7d假手術(shù)組（Sham operation group of 7day） 16.17±5.31 182.44±7.97 7d模型組（model opertion group of 7day） 28.75±5.82＊＊ 171.11±7.93＊＊7d電針組（EA group of 7day） 27.75±5.01＊＊ 178.99±9.57△14d假手術(shù)組（Sham operation group of 14day） 15.33±6.10 180.82±7.51 14d模型組（model opertion group of 14day） 37.25±6.98＊＊ 154.53±8.04＊＊14d電針組（EA group of 14day） 33.58±6.72＊＊ 172.49±12.03＊△△21d假手術(shù)組（Sham operation group of 21day） 15.08±5.26 181.95±6.45 21d模型組（model opertion group of 21day） 26.92±6.37＊＊ 169.56±9.97＊＊21d電針組（EA group of 21day） 19.83±6.91△△ 181.90±10.53△△

討 論

Nestin是一種胚胎性中間絲蛋白，在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，表達(dá)于多潛能神經(jīng)前體細(xì)胞胞質(zhì)中，因此nestin已成為鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的重要標(biāo)志蛋白之一［2］。成年鼠海馬齒狀回顆粒下層存在著神經(jīng)干細(xì)胞，為了保持齒狀回顆粒細(xì)胞定期死亡后細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定，顆粒下層的神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)以同樣的速度進(jìn)行增殖［3］。在缺血等病理性損傷時(shí)，齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞也可以增殖、遷移及分化為神經(jīng)元，參與受損神經(jīng)元的自我修復(fù)，但腦缺血刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量不足，而且調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖、遷移、分化以及神經(jīng)元修復(fù)和突觸形成的因子也不足［4］，因此，需要介入適當(dāng)?shù)闹委熓侄我源龠M(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，加速神經(jīng)功能的恢復(fù)［5］。

Kluska等［6］研究發(fā)現(xiàn)，成年大鼠局灶性腦梗死后，能刺激齒狀回區(qū)的神經(jīng)再生，本研究結(jié)果也顯示，腦缺血后齒狀回顆粒下區(qū)nestin在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均增加，7d時(shí)表達(dá)最多，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，nestin陽性細(xì)胞逐漸減少，表達(dá)強(qiáng)度也逐漸降低，神經(jīng)缺損癥狀恢復(fù)不明顯，結(jié)果表明腦缺血可以刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但這種自我調(diào)節(jié)的能力是有限的，尚不足以持續(xù)修復(fù)受損神經(jīng)元。在給予電針治療后，nestin陽性細(xì)胞的數(shù)量及表達(dá)強(qiáng)度均顯著提高，神經(jīng)缺損評(píng)分明顯降低，說明電針可以增強(qiáng)腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，改善神經(jīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為未成熟神經(jīng)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞［7］，因此電針治療后，可能通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化，修復(fù)受損神經(jīng)元，恢復(fù)神經(jīng)功能［8］，這可能是電針對(duì)腦缺血產(chǎn)生治療作用的重要機(jī)制之一。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一種神經(jīng)細(xì)胞，廣泛分布于腦的各個(gè)區(qū)域，能維持神經(jīng)元的正常功能，在神經(jīng)元的發(fā)育、遷移、突觸連接的形成中扮演了重要角色［9，10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生可以吞噬壞死組織碎片、充填神經(jīng)元損傷后產(chǎn)生的空缺，并可以降低谷氨酸等有毒分子對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，還能夠分泌多種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用的細(xì)胞因子等［11］，因而對(duì)受損神經(jīng)元起到代償和修復(fù)作用。但過度增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞，也可能分泌毒性細(xì)胞因子等有害物質(zhì)，加劇神經(jīng)元的損傷，并且可形成瘢痕，導(dǎo)致軸突的再生障礙［12］。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白，其表達(dá)量的多少可作為腦損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞活化及增殖的標(biāo)志［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血后7d時(shí)齒狀回GFAP的表達(dá)即明顯增加，至14d時(shí)陽性細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)烈，突起變粗，21d時(shí)的表達(dá)依然較高，顯示腦缺血能明顯刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生，是機(jī)體的代償性保護(hù)反應(yīng)。電針治療7、14、21d后，GFAP的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，相同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，表明電針抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化及增殖狀態(tài)，為神經(jīng)再生和功能重建提供了更有利的生存環(huán)境［14，15］。楊卓欣等［16］研究證實(shí)，腦缺血后海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，電針治療后可明顯抑制其過度增殖，并可以促進(jìn)其分化。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，電針能明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，其作用機(jī)制可能與其促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)再生，下調(diào)GFAP的持續(xù)過度表達(dá)，干預(yù)星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)有關(guān)。但神經(jīng)干細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元發(fā)生分化、遷移的分子機(jī)制如何，尚需進(jìn)一步深入研究。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et a1.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranieetomy in rats.Stroke，1989，20（1）：84－91

［2］Li Y，Chopp M.Temporal profile of nestin expression after focal cerebral ischemia in adult rat.Brain Res，1999，838（1－2）：1－10

［3］Wiltrout C，Lang B，Yan Y，et al.Repairing brain after stroke：A review on post－ischemic neurogenesis.Neurochem，Int，2007，50（7－8）：1028－1041

［4］周盛年，孫弦，韓永濤等.神經(jīng)干細(xì)胞與腦缺血治療的相關(guān)研究.中國(guó)卒中雜志，2008，3（5）：381－384

［5］趙海英，樊小農(nóng)，齊兆雙等.針刺對(duì)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的作用以及機(jī)制探究.針灸臨床雜志，2012，28（8）：68－70

［6］Kluska MM，Witte OW，Bolz J，et al.Neurogenesis in the adult dentate gyrus after cortical infarcts：effects of infarct location，N－methyl－D－aspartatereceptor blockade and anti－inflammatory treatment.Neuroscience，2005，135（3）：723－735

［7］Xin Y，Guo－h(huán)ua J，Xin－h(huán)ua Z，et al.Cortical endogenic neural regeneration of adult rat after traumatic brain injury.Plos One，2013，8（7）：e70306

［8］Yang Z，Yu H，Rao X，et al.Effects of electroacupuncture at the conception vessel on proliferation and differentiation of nerve stem cells in the inferior zone of thelateral Ventricle in cerebral ischemia rats.J Tradit Chin Med，2008，28（1）：58－63

［9］Nimmerjahn A.Astrocytes going live：advances and challenges.J Physiol，2009，587（8）：1639－1647

［10］Eroglu C.The role of astrocyte－secreted matricellular proteins in central nervous system development and function.J Cell Commun Signal，2009，3（3）：167－176

［11］Hamby ME，Sofroniew MV.Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders.Neurotherapeutics，2010，7（4）：494－506

［12］Sofroniew MV.Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.Trends Neurosci，2009，32（12）：638－647

［13］Kajihara H，Tsutsumi E，Kinoshita A，et al.Activated astrocytes with glycogen accumul－ation in ischemic penumbra during the early stage of brain infraction：Immunohistochemical and electron microscopic studies.Brain Res，2001，909（1－2）：92－101

［14］羅燕，許能貴，易瑋等.電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠大腦皮層缺血灶周圍區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響.針刺研究，2009，34（2）：101－105

［15］甘云波，黃光英，張明敏.針刺對(duì)腦缺血膠質(zhì)增生的影響.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（3）：229－331

［16］楊卓欣，于海波，羅文舒等.針刺任脈和督脈對(duì)腦缺血大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5（31）：7－9