李徽徽 汪華學 柴繼俠 高 琴

（1蚌埠醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室；2蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，安徽 233004；3生理學教研室，安徽 233030）

膿毒癥（Sepsis）是嚴重創(chuàng)傷、休克等常見的并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），病死率高達30－50%。腎臟是膿毒癥患者最易受損的臟器之一，易引起急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的發(fā)生［1］。膿毒癥致 AKI的病理生理機制可能與缺血/再灌注損傷、炎癥瀑布效應、細胞凋亡等損傷密切相關(guān)。因此本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥致AKI大鼠模型，探討不同病程階段大鼠血清和腎臟組織中炎癥介質(zhì)的變化，并觀察腎臟組織中NF－κB的表達，為臨床防治膿毒癥致AKI提供新的治療靶點。

材料和方法

1.試劑與材料

健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，體重250－300g，由蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：0005237，許可證號：SCXK2009（蘇）－0001。NF－κB p65兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑均購自武漢博士德生物科技有限公司。大鼠TNF－α和IL－6定量ELISA試劑盒購自美國R＆D公司；Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自MBI Fermentas公司；引物（TLR4、HMGB1、β－actin）均由上海生物工程公司合成。引物序列見表1。

表1 各種基因引物序列Table1 The primer squences for each gene

2.動物模型建立與分組

2.1 分組

健康雄性SD鼠36只。適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組（Sham組）和盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）。每組各18只，再隨機分為3個時間點（6h、12 h和24h），每組每時間點各6只。各時間點采集大鼠血液及腎臟組織標本，各個時間點之前死亡的大鼠排除在外。

2.2 大鼠膿毒癥模型的建立

雄性SD大鼠，術(shù)前禁食12h，自由飲水。4%水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉，固定、消毒、鋪巾，采用Rittirsch D等［2］的方法，腹部正中切開1.5cm，輕柔地找出盲腸，CLP組用3－0絲線結(jié)扎盲腸根部（避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管），并用無菌18G針頭對穿兩次，輕擠出少量腸內(nèi)容物以保證戳孔的通暢性。之后，按生理位置還納盲腸，逐層縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)畢，立即給大鼠皮下注射生理鹽水2ml/100g抗休克。術(shù)后大鼠允許自由飲水、進食。Sham組除不結(jié)扎和穿孔盲腸外，其余操作均同CLP組。

3標本的采集及檢測方法

3.1 血標本的采集

右側(cè)頸總動脈采血4ml，臺式離心機4℃，3000 rpm/min離心15min后，收集血清，－80℃冰箱保存。ELISA檢測大鼠血清TNF－α和IL－6水平。

3.2 RT－PCR檢測大鼠腎臟組織中TLR4和HMGB1mRNA表達

腎臟組織（皮質(zhì)兼髓質(zhì)）100mg，采用Trizol一步法提取總RNA，取總RNA 4μg，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 1μl為模板，進行PCR擴增。擴增條件：95℃預變性3min，隨后①95℃50s變性，②β－actin退火溫度59.4℃50s；TLR4退火溫度59.3℃50s；HMGB1退火溫度56.0℃50s，③72℃60s，反應30個循環(huán)，最后一輪延伸10min。將4μl PCR擴增產(chǎn)物與1μl溴酚蘭混勻，于質(zhì)量濃度為15g/L的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）顯色。在GIS凝膠處理系統(tǒng)中拍攝記錄，使用圖像分析軟件對凝膠中每一泳帶進行半定量分析，以目的基因與內(nèi)參對照的吸光度比值（TLR4/β－actin；HMGB1/β－actin）表示mRNA相對表達量。

3.3 免疫組化測定腎小管中NF－κB p65的表達

取部分腎臟組織（皮質(zhì)兼髓質(zhì)）置于4%多聚甲醛固定液中固定。石蠟包埋，切成5μm薄片，脫蠟、水化，枸櫞酸鹽高溫修復抗原，過氧化氫封閉。一抗4℃過夜。二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸乙醇分化，氨水反藍，脫水、透明、封片。高倍顯微鏡下隨機觀察十個視野，腎小管細胞核中出現(xiàn)NF－κB p65棕色顆粒的細胞數(shù)占腎小管細胞總數(shù)的百分比為NF－κB p65核陽性率。以NF－κB p65核陽性率反映NF－κB的活化程度。

4統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，q檢驗和t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

結(jié) 果

1.各組大鼠血清 TNF－α和IL－6水平

隨時間延長，Sham組大鼠血清TNF－α和IL－6水平無明顯差異（P＞0.05），CLP組大鼠血清TNF－α和IL－6水平先有明顯升高，然后迅速降低（P＜0.01）。與同時間點Sham組比較，CLP組6h和12h大鼠血清TNF－α和IL－6水平明顯升高（P＜0.01），24h大鼠血清 TNF－α和IL－6水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 各組大鼠血清TNF－α和IL－6水平（ni＝6；±s）Table2 The levels of TNF－αand IL－6in serum of different groups（ni＝6；±s）

表2 各組大鼠血清TNF－α和IL－6水平（ni＝6；±s）Table2 The levels of TNF－αand IL－6in serum of different groups（ni＝6；±s）

b，與同時間點Sham組比較，p＜0.01；c，與同組6h組比較，p＜0.01；e，與同組12h組比較，p＜0.01。b，versus time－matched Sham group，p＜0.01；c，versus group－matched 6hgroup，p＜0.01；e，versus group－matched 12hgroup，p＜0.01.

Group Time after model established（h）6 12 24 TNF－α（pg/ml）Sham group 95.52±4.85 98.30±6.26 97.24±6.73 CLP group 195.59±7.38b 172.01±15.64bc 105.20±4.13ce IL－6（pg/ml）Sham group 49.60±3.75 51.43±2.61 50.64±3.93 CLP group 92.80±2.27b 85.22±10.23b 54.72±5.04ce

2.各組大鼠腎臟組織中TLR4mRNA表達

隨時間延長，Sham組大鼠腎臟組織中TLR4 mRNA的表達無顯著差別（P＞0.05），CLP組大鼠腎臟組織中TLR4mRNA先升高，至12h達到高峰，隨后開始下降（P＜0.01～P＜0.05）。與同時間點Sham組比較，CLP組各時間點大鼠腎臟組織中TLR4mRNA的表達均高于Sham組（P＜0.01）（表3，圖1）。

表3 各組大鼠腎臟組織中TLR4mRNA和HMGB1mRNA的表達（ni＝6；±s）Table3 The expressions of TLR4mRNA and HMGB1mRNA in kidney tissue of different groups（ni＝6；±s）

表3 各組大鼠腎臟組織中TLR4mRNA和HMGB1mRNA的表達（ni＝6；±s）Table3 The expressions of TLR4mRNA and HMGB1mRNA in kidney tissue of different groups（ni＝6；±s）

與同時間點Sham組比較，b P＜0.01；與同組6h組比較，c P＜0.01；與同組12h組比較，d P＜0.05，e P＜0.01。b P＜0.01versus time－matched Sham group；c P＜0.01versus group－matched 6hgroup；d P＜0.05versus group－matched 12hgroup；e P＜0.01versus group－matched 12hgroup.

Group Time after model established（h）6 12 24 TLR4/β－actin Sham group 0.18±0.02 0.17±0.02 0.17±0.03 CLP group 0.31±0.06b 0.57±0.90bc 0.48±0.06bcd HMGB1/β－actin Sham group 0.30±0.06 0.31±0.06 0.29±0.04 CLP group 0.34±0.07 0.48±0.05bc 0.62±0.06bce

3.各組大鼠腎臟組織中HMGB1mRNA表達

隨時間延長，Sham組大鼠腎臟組織中HMGB1 mRNA的表達無顯著差別（P＞0.05），CLP組大鼠腎臟組織中HMGB1mRNA的表達逐漸升高（P＜0.01）。與同時間點Sham組比較，CLP組12h和24h大鼠腎臟組織中HMGB1mRNA的表達明顯高于Sham組（P＜0.01）（表3，圖2）。

4.各組大鼠腎小管中NF－κB p65的表達

Sham組各時間組大鼠腎小管中NF－κB p65的表達均位于胞漿中，淡染，為弱陽性表達，胞核中極少或沒有陽性表達（P＞0.05）。CLP組隨時間延長大鼠腎小管中NF－κB p65棕色顆粒逐漸出現(xiàn)在細胞核中，NF－κB p65核陽性率逐漸升高。與同時間點Sham組比較，CLP組6h、12h和24h大鼠腎小管中NF－κB p65核陽性率高于Sham組（P＜0.05～P＜0.01）（表4，圖3）。

圖1 各組大鼠腎臟組織中TLR4mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 TLR4mRNA agarose gel electrophoresis of different groups

圖2 各組大鼠腎臟組織中HMGB1mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 HMGB1mRNA agarose gel electrophoresis of different groups

表4 各組大鼠腎小管中NF－κB p65核陽性率（ni＝6；±s）Table4 The nuclear positive rates of NF－κB p65in renal tubules of different groups（ni＝6；±s）

表4 各組大鼠腎小管中NF－κB p65核陽性率（ni＝6；±s）Table4 The nuclear positive rates of NF－κB p65in renal tubules of different groups（ni＝6；±s）

a，b，與同時間點Sham組比較，p＜0.05，p＜0.01；c，與同組6h組比較，p＜0.01；e，與同組12h組比較，p＜0.01。a，versus time－matched Sham group，p＜0.05；b，versus time－matched Sham group，p＜0.01；c，versus group－matched 6hgroup，p＜0.01；e，versus group－matched 12hgroup，p＜0.01.

Group Time after model established（h）6 12 24 The nuclear positive rates of NF－κB p65（%）Sham group 1.10±0.26 1.13±0.25 1.18±0.17 CLP group 3.08±0.71a 9.13±1.46bc 18.10±3.31bce

圖3 各組大鼠腎小管中NF－κB p65的表達（SP×400）A：Sham組大鼠腎小管中NF－κB p65的表達；B：CLP組6h大鼠腎小管中NF－κB p65的表達；C：CLP組12h大鼠腎小管中NF－κB p65的表達；D：CLP組24h大鼠腎小管中NF－κB p65的表達。Fig.3 The expression of NF－κB p65in rat renal tubules of different groups（SP×400）A：The expression of NF－κB p65in rat renal tubules of Sham group；B：The expression of NF－κB p65in rat renal tubules of CLP group at 6hour；C：The expression of NF－κB p65in rat renal tubules of CLP group at 12hour；D：The expression of NF－κB p65in rat renal tubules of CLP group at 24hour.

討 論

膿毒癥是機體在感染因素的作用下產(chǎn)生的失控的自我放大和自我破壞的全身炎癥反應綜合征。盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）是復制膿毒癥模型的經(jīng)典方法之一，通過有菌的腸內(nèi)容物從盲腸穿孔處溢出，污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發(fā)機體全身性、破壞性炎性反應，復制出多種微生物感染的膿毒癥模型［3］，是迄今為止最貼近臨床膿毒癥病理生理過程的動物模型［4］，被認為是膿毒癥研究動物模型的“金標準”。腎臟是膿毒癥最常受累的器官之一，有實驗證實CLP術(shù)后可以引起大鼠血清肌酐和尿素氮顯著增高，腎小體中血管球淤血、皺縮，腎小囊腔擴大，腎小管上皮細胞腫脹，腎臟組織中炎性細胞浸潤等，導致急性腎損傷［5］。

膿毒癥的核心是全身炎癥反應與代償性抗炎反應的失衡，炎癥介質(zhì)在其發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。早期釋放的炎癥介質(zhì)如TNF－α，IL－6等可以引起機體損傷和死亡，對判斷膿毒癥的嚴重程度起到重要作用。膿毒癥感染時所釋放的毒素以及活化的炎癥細胞釋放的炎癥介質(zhì)都可以作用于機體的防御系統(tǒng)，激活具有信號轉(zhuǎn)導功能的TLR4，經(jīng)過一系列級聯(lián)信號傳遞，激活NF－κB及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，繼而啟動TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8等促炎細胞因子和黏附分子等基因的轉(zhuǎn)錄。這些炎癥介質(zhì)又可以進一步激活機體的防御系統(tǒng)，二者互為因果，形成炎癥瀑布（inflammatory cascade），造成炎癥介質(zhì)持續(xù)過度釋放，最終導致以細胞自身破壞為特征的全身性炎癥反應綜合征 （systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。本研究中觀察到膿毒癥致AKI早期，大鼠血清TNF－α水平明顯升高，并刺激機體釋放IL－6，擴大生物學效應，6～12h大鼠血清TNF－α和IL－6水平達到一個峰值，隨著大鼠腹腔感染的進一步加重，TNF－α和IL－6水平并未持續(xù)升高，反而迅速降低，至24h逐漸恢復至正常水平，而此時正是腹腔感染的高峰期。由于TNF－α和IL－6具有釋放早，恢復快的特性，作為早期炎癥介質(zhì)難以用于臨床監(jiān)測。而且這些促炎細胞因子表達水平的變化不能完全客觀的反映機體膿毒癥的嚴重狀況，也不適用于療效的觀察和預后的判斷。

1999年Wang等首次提出.HMGB1作為關(guān)鍵的晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過程，且比早期炎癥介質(zhì)如TNF－α和IL－6等具有更大的臨床意義。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信號通路是HMGB1轉(zhuǎn)錄的重要通路。有研究表明［6］，膿毒癥感染時所釋放的毒素及炎癥介質(zhì)都可以通過激活TLR4，進而經(jīng)過JAK，IFN－β，STAT－1等生物分子傳遞信號，通過 TLR4/IFN－β/STAT－1信號軸最終引起 HMGB1的釋放。本研究中也觀察到伴隨膿毒癥致AKI大鼠腎臟組織中TLR4mRNA表達的升高，腎臟組織中HMGB1mRNA表達逐漸升高，當TLR4mRNA表達升高達到高峰后，隨后開始下降，而HMGB1 mRNA表達依然升高，可能與HMGB1和單核/巨噬細胞分泌TNF－α和IL－6等炎癥介質(zhì)相互誘導，正反饋式擴大全身炎癥反應有關(guān)。同時也證實了HMGB1作為關(guān)鍵性晚期炎癥介質(zhì)，相對于TNF－α、IL－6等早期炎癥介質(zhì)而言，具有釋放晚、維持峰值時間長等特點［7］，為臨床的監(jiān)測和治療提供了新的“靶點”和“時間窗”。

NF－κB在腎小體中系膜細胞、內(nèi)皮細胞，腎小管上皮細胞和由血循環(huán)浸潤的血液免疫細胞均存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控。膿毒癥感染時，釋放的毒素以及炎癥介質(zhì)，通過激活TLR4介導的細胞內(nèi)傳導，使無活性的p50/p65/IκB三聚體上IκB發(fā)生構(gòu)象改變，被IκB抑制的NF－κB游離出來，成為有活性的NF－κB。同時HMGB1可與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end－products，RAGE）結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶途徑（Ras）和絲裂原活化蛋白激酶途徑（MAPK），導致NF－κB活化。激活的NF－κB迅速穿過核孔，進入細胞核，啟動 TNF－α，IL－6等細胞因子的基因表達，這些細胞因子又進一步激活NF－κB，使其活性進一步增強，形成正反饋的級聯(lián)放大效應。因此，NF－κB的激活是觸發(fā)過度炎癥反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在膿毒癥的發(fā)病過程中起著重要作用。本次研究觀察到，Sham組各組大鼠腎小管中NF－κB p65在靜息狀態(tài)下，以無活性復合物形式存在于細胞質(zhì)中，著色較淺，胞核中極少或沒有NF－κB p65陽性表達，CLP組由于腹腔的感染、毒素的刺激、TNF－α水平和 HMGB1表達升高等因素，NF－κB被激活，移位進入細胞核內(nèi)，NF－κB p65核陽性率逐漸增加。且隨著病程延長，腎小管中NF－κB p65的核陽性率明顯增加，并與腎臟組織中HMGB1mRNA表達呈正相關(guān)，提示腎臟組織內(nèi)的NF－κB與HMGB1密切相關(guān)，可能參與了膿毒癥致AKI的病變過程。

膿毒癥感染釋放的毒素，炎癥介質(zhì)等都可激活TLR4介導的炎癥通路，通過激活髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor，Myd88）依賴性和非依賴性信號轉(zhuǎn)導通路，從而激活下游的MAPK信號轉(zhuǎn)導通路和 NF－κB信號通路［8－9］，激活 NF－κB，誘導TNF－α和IL－6等炎癥介質(zhì)的釋放。此外激活的TLR4通過JAK/STAT信號通路引起HMGB1釋放，釋放的HMGB1可以與RAGE結(jié)合，活化NF－κB，加速炎癥介質(zhì)的過度釋放，這些炎癥介質(zhì)又能與HMGB1相互誘導，正反饋式擴大全身炎癥反應，出現(xiàn)炎癥瀑布，在炎癥反應后期對維持炎癥反應起到了重要的作用。因此，探索TLR4信號通路介導的膿毒癥致AKI大鼠血清和腎臟組織中炎癥介質(zhì)的改變和腎臟組織中NF－κB的表達，為研究膿毒癥致AKI的病理生理過程奠定了基礎(chǔ)，為臨床上治療膿毒癥致AKI提供了實驗依據(jù)。

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