李紅偉 李多杰 江 浩 汪朝歌 崔 珍

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院放療科，安徽 233003）

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國主要是以鱗癌為主。食管癌早期癥狀不明顯，出現(xiàn)疼痛及梗阻癥狀已經是晚期，臨床上該腫瘤易局部浸潤及淋巴結轉移。本實驗通過檢測食管鱗癌組織中claudin5及MMP－13的蛋白表達情況，旨在尋找與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移相關的免疫標記物，為臨床早期診斷及判定預后提供分子學依據(jù)。

材料和方法

1.一般材料

收集2007－2008年臨床病理科食管鱗狀細胞癌石蠟包埋組織90例，其中女性21例，男性69例；年齡在38－79歲之間，中位年齡59歲。其中高分化鱗癌24例，中分化鱗癌45例，低分化鱗癌21例；腫瘤局限在粘膜層至淺肌層的20例，浸潤至深肌層到外膜層的70例；無淋巴結轉移患者52例，有局部和遠處淋巴結轉移患者38例；同時挑選手術標本距腫瘤邊緣5.0cm以上遠端切緣組織28例做正常對照。

2.主要試劑

claudin5及 MMP－13一抗（兔抗人）均購自NeoMarkers公司。免疫組化試劑盒購自福州邁新生物有限公司。

3.實驗方法

采用免疫組化Elivision方法對90例食管鱗癌組織及28例癌旁正常黏膜組織進行claudin5及MMP－13染色?？贵w滴度分別為1∶100；1∶200，具體操作參見免疫組化試劑盒說明書，用PBS代替一抗做陰性對照，用皮膚和乳腺癌組織分別做陽性對照。

4.結果判定及統(tǒng)計學分析

claudin5及MMP－13的染色定位于細胞漿，胞漿內出現(xiàn)黃色及棕黃色顆粒為陽性細胞。結果觀察采用雙盲法，每張切片隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞數(shù)及觀察顯色程度，陽性強度用半定量法，按陽性細胞所占得百分數(shù)評分：陽性細胞＜10%為0分，10%－50%為1分，51%－75%為2分，＞75%為3分。細胞不著色為0分，淺黃為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。兩者分數(shù)相乘0－2分為陰性（－），≥3分為陽性（＋）。

5.統(tǒng)計學處理

采用spass 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，兩變量相關分析采用spearman等級相關檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.claudin5及 MMP－13蛋白在食管鱗癌及食管癌旁上皮組織中的表達

在食管鱗癌細胞中，claudin5及MMP－13蛋白均定位于細胞漿。claudin5蛋白在90例食管鱗癌組織及正常黏膜組織中的陽性表達率分別為85.56%（77/90）、25.00%（7/28）在食管鱗癌中的表達明顯高于正常黏膜組織（P＜0.05）。MMP－13蛋白在90例食管鱗癌組織及正常黏膜組織中的陽性表達率分別為82.22%（74/90）、21.43%（6/28），在食管鱗癌中的表達顯著高于正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1、圖1－4）。

圖1 Clandin5在食管粘膜組織中的陰性表達（Elivision法 ×400）Fig.1 Negative expression of clandin5in normal tissues（Elivision method×400）

圖2 Clandin5在食管鱗癌中的強陽性表達，（Elivision法 ×400）Fig.2 Strong positive expression of clandin 5in ESCC（Elivision method×400）

圖3 MMP－13在食管正常粘膜組織中的弱陽性表達，（Elivision法 ×100）Fig.3 Weak positive expression of MMP－13in normal tissues（Elivision method×100）

圖4 MMP－13在食管鱗癌中的強陽性表達，（Elivision法×400）Fig.4 Strong positive expression of MMP－13in ESCC MMP－13（Elivision method×400）

表1 Claudin5和MMP－13蛋白在正常組織及食管鱗癌中的表達Table1 Expression of Claudin5and MMP－13protein from normal tissue and ESCC

2.食管鱗癌中claudin5及 MMP－13蛋白的表達及臨床病理參數(shù)之間的關系

在90例食管鱗癌中，MMP－13蛋白在無淋巴結轉移的50例患者中有35例陽性表達，有淋巴結轉移的40例患者中有39例陽性表達；臨床分期為Ⅰ期患29例中有19例陽性表達，Ⅱ期患者40例中有37例陽性表達，Ⅲ＋Ⅳ期患者21例中有18例陽性表達，MMP－13蛋白與食管鱗癌的淋巴結轉移及臨床分期密切相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與患者年齡、性別、浸潤深度及分化程度無關。在90例食管鱗癌中，claudin5蛋白的表達程度與患者年齡、性別、浸潤深度、分化程度、有無淋巴結轉移及臨床分期均無相關性（P＞0.05）（表2）。

表2 食管癌中Claudin5和MMP－13蛋白的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關系Table2 The relationship of Claudin5and MMP－13expression and clinicopathological manifestations in ESCC

3.claudin5及 MMP－13蛋白在食管鱗癌中表達的相關性分析

在90例食管鱗癌組織中，claudin5及MMP－13蛋白均陽性表達的71例，均陰性表達的10例，claudin5陽性而MMP－13陰性表達的6例，claudin5陰性而MMP－13陽性表達的3例。claudin5及MMP－13蛋白在食管鱗癌中的表達呈正相關（r＝0.6356，P＜0.05）（表3）。

表3 Claudin5和MMP－13蛋白在食管癌中表達的相互關系Table3 Correlation of Claudin5and MMP－13in ESCC

討 論

腫瘤的浸潤和轉移是腫瘤預后較差的主要原因，食管癌早期癥狀不明顯，易發(fā)生局部浸潤及淋巴結轉移。腫瘤的局部浸潤和轉移是多步驟、多基因共同改變的結果。細胞緊密連接的破壞和細胞外基質的降解是腫瘤浸潤轉移的必備條件。

claudin蛋白家族是分子量從17－27kDa的跨膜緊密連接蛋白，到目前為止已發(fā)現(xiàn)有24個成員［1］。它們構成了緊密連接的主要骨架，與連接黏附分子和Occludin構成了細胞間緊密連接的主要膜蛋白。Claudin蛋白對維持細胞極性，形成屏障，阻止液體、膜蛋白及小分子的側向擴散及細胞頂部和基底部的完整性起到重要作用。同一種Claudin蛋白可以在不同的組織中表達，同一種組織也可以表達幾種Claudin蛋白。不同的Claudin蛋白可能會形成不同結構的緊密連接。Claudin蛋白是通過形成多聚體并和周圍細胞的Claudin蛋白相互作用構成了細胞間的連接骨架。人體正常的細胞緊密連接的構成是比較規(guī)律的，在腫瘤組織中claudin蛋白的表達異常或與其他蛋白連接異常，組織學上表現(xiàn)為分化差，細胞極性紊亂或消失。緊密連接的完整性破壞是導致腫瘤細胞浸潤和轉移的重要原因之一。claudin5是claudin蛋白家族的重要成員，最初研究發(fā)現(xiàn)claudin5在良性脈管腫瘤及血管肉瘤中高表達［2］，但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)claudin5在前列腺癌、肺癌、乳腺癌［3－5］等多種惡性腫瘤中均有表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常食管黏膜組織中claudin5蛋白的陽性表達率為25.00%，而在食管鱗癌組織中的陽性表達率為85.56%，claudin5蛋白在食管鱗癌組織中表達明顯增強，其蛋白表達可能與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關，可能會成為食管鱗癌早期診斷的重要分子標記物。但claudin5蛋白的表達與臨床各病理參數(shù)之間均無相關性。

MMP－13是基質金屬蛋白酶家族（MMPS）的重要成員之一，在1994年首先從乳腺癌中被分離出來［6］。MMP－13屬于膠原酶，以酶原的形式分泌到細胞外基質中，其主要功能是降解基底膜及細胞外基質，促進腫瘤細胞突破基底膜和細胞外基質構成的組織學屏障，促進腫瘤細胞侵襲及轉移［7］。除此之外它還具有激活家族其他基質金屬蛋白酶及促進腫瘤血管生成的作用。研究發(fā)現(xiàn)［8］MMP－13可激活MMP－2、9，同時 MMP－2、9也可以激活 MMP－13。MMP－13在多種惡性腫瘤中均有表達。Wang［9］等研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌中MMP－13表達增強而周圍正常甲狀腺濾泡不表達，有局部淋巴結轉移的病人MMP－13的表達率明顯增加，且轉移至淋巴結邊緣的癌細胞 MMP－13的表達量明顯增強。Yang［10］等在結直腸癌中研究發(fā)現(xiàn) MMP－13在癌組織中高表達，且其表達率與腫瘤的分化程度、臨床分期及淋巴結轉移密切相關，此外MMP－13的表達與結直腸癌的生存時間有關。本研究實驗發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織中MMP－13的陽性表達率為82.22%，在食管黏膜組織中的陽性表達率為21.43%，在食管鱗癌中的表達明顯高于正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計學意義。MMP－13可能在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程起重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結轉移的病人MMP－13的陽性表達高于沒有淋巴結轉移的病人，TNM分期Ⅲ＋Ⅳ期患者MMP－13蛋白的表達明顯高于Ⅰ和Ⅱ期患者，MMP－13的陽性表達與淋巴結轉移及臨床分期有關，差異具有統(tǒng)計學意義。因此MMP－13可能為判斷食管癌預后提供重要的分子學依據(jù)。

本研究還發(fā)現(xiàn)隨著clandin5蛋白的表達增強MMP－13蛋白的表達水平增加，兩者存在正相關，差異具有統(tǒng)計學意義?？赡芤驗閏landin5蛋白的過表達激活了 MMP－13，使其功能增強。Agarwal等［11］研究MMP和Claudin在卵巢癌細胞中的表達與本研究結果類似，，他們發(fā)現(xiàn)Claudin3、4的表達促進腫瘤細胞的侵襲及運動，而這種表現(xiàn)可能是Claudin3、4增加了基質金屬蛋白酶－2（MMP－2）的活性，具體機制有待于進一步研究。

［1］Tsukita S，F(xiàn)uruse M，Itoh M.Multifunctional strands in tight junctions.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（4）：285－293

［2］Hara H.Endoglin（CD105）and claudin－5expression in cutaneous angiosarcoma.Am J Dermatopathol，2012，34（7）：779－782

［3］Coutinho－Camillo CM，Lourenco SV，da Fonseca FP，et al.Claudin expression is dysregulated in prostate adenocarcinomas but does not correlate with main clinicopathological parameters.Pathology，2011，43（2）：143－148

［4］Merikallio H，Kaarteenaho R，P??kk?P，et al.Zeb1and twist are more commonly expressed in metastatic than primary lung tumours and show inverse associations with claudins.Clin Pathol，2011，64（2）：136－140

［5］Szasz AM，Tokes AM，Micsinai M，et al.Prognostic significance of claudin expression changes in breast cancer with regional lymph node metastasis.Clin Exp Metastasis，2011，28（1）：55－63

［6］FreijeJMP，Diez2Itza I，BalbinM，et al.1Molecular cloningandexpres2sionofcollagenase23，anovel human matrixmetalloproteinase produced by breast carcinomas.Biol Chem，1994，269（24）：16766－16773

［7］Kleiner DE，Stetler－Stevenson WG.Matrix metalloproteinases and metastasis.Cancer Chemother Pharmacol，1999，43（Suppl）：42－51

［8］Leeman MF，Curran S，Murray GI1The structure，regulation， andfunctionof humanmatrixmetalloproteinase213.Critical Reviews inBiochemistryandMolecular Biology，2002，37（3）：149－166

［9］Wang JR，Li XH，Gao XJ，et al.Expression of MMP－13 is associated with invasion of papillary thyroid carcinoma.Eup Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（4）：427－435

［10］Yang B，Gao J，Rao Z，et al.Clinicopathological significance and prognostic value of MMP－13expression in colorectal cancer.Scand J Clin Lab Invest，2012，72（6）：501－505

［11］Agarwal R，D′Souza T，Morin PJ.Claudin－3andclaudin－4expression in ovarian epithelial cells enhances invasion an disassociated with increased Matrixmetalloproteinase－2activity.Cancer Res，2005，65：7378－7385