閆寧環(huán)，陳偉，錢(qián)文濤，季國(guó)志，李洪亮，母智深

（1.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特011503，2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

采用GC測(cè)定調(diào)制乳中4種植物甾醇的檢測(cè)方法

閆寧環(huán)1，陳偉2，*，錢(qián)文濤2，季國(guó)志2，李洪亮2，母智深2

（1.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特011503，2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

對(duì)調(diào)制牛乳中植物甾醇的測(cè)定方法進(jìn)行了研究。樣品在2 mol/L乙醇?xì)溲趸?0℃超聲水浴處理15 min后，在60℃水浴中處理45 min進(jìn)行皂化處理，正庚烷萃取后，再通過(guò)吡啶及MSTFA，在80℃水浴保溫10 min進(jìn)行衍生化。處理好的樣品利用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：按照該法，測(cè)定的調(diào)制牛乳中四種植物甾醇的含量為170 mg/100 g，標(biāo)準(zhǔn)品的回收率（以豆甾醇記）為86.59%～103.09%，此法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。

調(diào)制乳；β-谷甾醇；菜籽甾醇；菜油甾醇；豆甾醇；高效氣相色譜

植物甾醇（phytohseterol or plant sterol）是一種植物中的活性成分，在結(jié)構(gòu)上與動(dòng)物甾醇如膽甾醇相似，主要包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和相應(yīng)的烷醇等。植物甾醇和膽甾醇都是以環(huán)戊烷并全氫菲為骨架（又稱甾核）的一種化合物，兩者僅側(cè)鏈不同。自然界中存在的植物甾醇有游離型和酯化型兩種，酯化型更易溶于有機(jī)溶劑，其吸收利用比游離型約提高5倍，功能作用也更加廣泛。純的植物甾醇在常溫下為白色結(jié)晶粉末，無(wú)臭無(wú)味，熔點(diǎn)可達(dá)130℃～140℃，大量研究表明，植物甾醇具有降低血液膽固醇、防治前列腺肥大、抗癌、類激素等多種生理功能[1]。

測(cè)定植物甾醇的方法較多，早期有毛地黃皂甙法、比色法、酶法等，這些方法只能測(cè)定植物甾醇的總含量，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)各各甾醇組分進(jìn)行分離定量。后來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道有化學(xué)法、薄層色譜法（TLC）、高新液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，在眾多的方法中，氣相色譜法（GC）具有分離效果好、分析速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，所以本研究在參照國(guó)外文獻(xiàn)及國(guó)內(nèi)對(duì)植物甾醇的測(cè)定方法的基礎(chǔ)上[2-4]，建立了調(diào)制乳中植物甾醇的測(cè)定方法，旨在為牛乳中添加植物甾醇提供監(jiān)督和檢驗(yàn)的依據(jù)。

植物甾醇在植物性食物中包括四種存在形式：即游離甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷和?；薮继擒?。因此，在分析研究樣品中植物甾醇含量時(shí)，應(yīng)根據(jù)樣品中植物甾醇的存在形式來(lái)確定徹底分離這4種甾醇的預(yù)處理方法，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

乙醇，分析純；氫氧化鉀（濃度C>86%），分析純；無(wú)水硫酸鈉，分析純；庚烷，分析純；吡啶，分析純；MSTFA（氮甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺），分析純；蒸餾水；β-谷甾醇（β-sitosterol），sigma公司生產(chǎn)，純度≥98%；菜籽甾醇（brassicasterol），sigma公司生產(chǎn)，純度100%；菜油甾醇（campestrol），sigma公司生產(chǎn)，純度≥98%；豆甾醇（stigmasterol），sigma公司生產(chǎn)，純度≥96.5%；2 mol/L乙醇?xì)溲趸洠悍Q取65.0 g氫氧化鉀（濃度C>86%）移入500 mL刻度燒瓶中，在氮?dú)庀掠靡掖既芙?，并定容?00 mL，在2℃溫度條件下保存。

1.1.2 儀器與材料

1.1.2.1 牛乳

來(lái)源于內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)，乳中添加植物甾醇酯，并殺菌后無(wú)菌灌裝。

1.1.2.2 儀器設(shè)備

具螺旋塞的20 mL玻璃試管；具螺旋塞的10 mL玻璃試管；1.5 mL的瓶蓋可卷曲的小瓶（自動(dòng)取樣器的安瓿）；玻璃滴管；IKA Vortex 4振動(dòng)混合器；Hitachi CR21GIII離心機(jī)；KS-80D可加熱的超聲水?。簩幉êＪ锟粕曉O(shè)備有限公司；Eurostar 100 Digital IKA高效攪拌器；KS-80D毛細(xì)柱氣相色譜儀（帶有FID檢測(cè)器，7890）：Agilent；毛細(xì)色譜柱：AT-5MS，60m×0.25mm/ DF=0.25 μm；注射器：1 μL。

1.1.2.3 氣相色譜法條件

載氣：氫氣，流速5.0 mL/min；載氣原始?jí)毫Γ?2 psi（1 psi=6.895 kPa）；注射器溫度：310℃；檢測(cè)器溫度：350℃；分流：100 mL/min；升溫程序：初始溫度200℃，初始時(shí)間0.5 min，速率2℃/min；中間溫度305℃，保持時(shí)間0 min，速率10℃/min；最終溫度345℃，保持時(shí)間6min；總流動(dòng)時(shí)間：63 min。

1.2 操作程序

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的處理

將β-谷甾醇（1 mg）用吡啶洗滌3次，分別稱取4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品4 mg～5 mg（精確到0.01 mg），合并到10 mL容量瓶中，用吡啶定容并搖勻。

精密量取上述溶液0.5 mL置于2 mL進(jìn)樣瓶中，加入0.5 mL MSTFA，在80℃水浴條件下反應(yīng)10 min，冷卻即可，進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.2 樣品預(yù)處理

稱取牛乳樣品（約含1.00 mg植物甾醇）放入20 mL具螺旋塞（水解安瓿）的玻璃試管中，加入500 μL水，將試管在室溫下超聲水浴中處理5 min，加入1 mL 2 mol/L乙醇?xì)溲趸洠瑢⒃嚬茉谑覝叵鲁曀≈刑幚? min，再加入4 mL 2 mol/L乙醇?xì)溲趸洠芊庠嚬?，?0℃超聲水浴處理15 min后，于60℃水浴中放置45 min，每隔15分鐘取出，放在振動(dòng)混合器中震搖2 min，冷卻待用。

精確量取6.0 mL正庚烷和4 mL水，在振動(dòng)混合器萃取5 min，然后在離心機(jī)中以4 300 r/min離心3 min，將上層有機(jī)液層用玻璃滴管轉(zhuǎn)移到另一只20mL玻璃試管中（萃取安瓿）。

向水解安瓿中精確加入6.0 mL正庚烷，在振動(dòng)混合器萃取5 min，然后在離心機(jī)中以4 300 r/min離心3 min，將上層有機(jī)液層用玻璃滴管轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的萃取安瓿，加入1.5 g硫酸鈉，在振動(dòng)混合器將萃取安瓿震搖5 min，然后在離心機(jī)中以4 300 r/min離心3 min，將5 mL濃縮溶液轉(zhuǎn)移到10 mL具螺旋塞試管，氮?dú)饬鲃?dòng)下，在70℃～80℃溫度條件下蒸發(fā)濃縮后，加入500 μL吡啶和500μLMSTFA，在80℃水浴條件下保溫10min，轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器安瓿，進(jìn)樣1 μL，按照氣相色譜條件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂化溫度

鮑忠定等[5]，采用毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定油中植物甾醇和膽固醇，并確定了樣品皂化的最佳條件，并采用2.0 mol/L的氫氧化鉀乙醇溶液在85℃水浴上皂化45 min，該法測(cè)定了芝麻油芝麻油，大豆色拉油，棕?cái)R油，豬油中甾醇的含量。尹鍵等[6]利用氣相色譜法測(cè)定煙草中的β-谷甾醇，研究發(fā)現(xiàn)直接將萃取組分進(jìn)行氣相色譜分析，不易實(shí)現(xiàn)分離，需將甾醇類酯化后再進(jìn)行測(cè)定，可得出較好的分離測(cè)定結(jié)果，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定酯化時(shí)間以24 h為佳。王江等[7]用GC測(cè)定了鹿角狀靈芝和片狀靈芝中植物甾醇（菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇）的含量。

馮妹元等[8]，最終采用了飽和氫氧化鉀進(jìn)行皂化，皂化時(shí)間為沸水浴30 min。標(biāo)準(zhǔn)品采用BSTFA+TMCS試劑[雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷]處理后，使甾醇的活性氫原子被硅烷基取代，使甾醇的熱穩(wěn)定性更高，更易揮發(fā)，同時(shí)其極性下降，檢驗(yàn)靈敏度提高。

結(jié)合上述資料，本實(shí)驗(yàn)在不同堿濃度（1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mol/L），皂化溫度（50、60、70、80、85℃）和皂化時(shí)間（15、30、45、60 min）條件下，測(cè)定牛乳中的植物甾醇。結(jié)果表明：加入1 mL 2 mol/L乙醇?xì)溲趸?，將試管在室溫下超聲水浴中處? min，加入4 mL 2 mol/L乙醇?xì)溲趸?，密封試管，放?0℃超聲水浴處理15 min，另在60℃水浴中放置45 min，每隔15 min后取出，放在振動(dòng)混合器中震搖2 min。調(diào)制乳中植物甾醇檢測(cè)圖譜如圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品GC-FID圖譜Fig.1 The GC-FID spectrum of standard sample

2.2 樣品回收率

采用加標(biāo)回收法，在牛乳中加入一定量的豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，按照樣品測(cè)定方法進(jìn)行處理后分析，結(jié)果表明，植物甾醇（以豆甾醇計(jì)）的平均回收率為86.59%～103.09%。

2.3 調(diào)制乳樣品中植物甾醇含量測(cè)定

稱取樣品0.5 g左右（含1.00 mg植物甾醇），采用上述方法進(jìn)行處理測(cè)定。記錄色譜圖，如圖2所示。

圖2 調(diào)制乳中植物甾醇GC-FID圖譜Fig.2 The plant sterol GC-FID spectrum of modified milk

分別計(jì)算β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇與標(biāo)樣的峰面積比計(jì)算調(diào)制乳中β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇的含量，將這四種甾醇的含量相加即為牛奶中總植物甾醇的含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 調(diào)制牛乳中植物甾醇的含量測(cè)定Table 1 Determination of four types plant sterol in modified milk

3 討論

1）牛乳中含有膽固醇，含量大約為10 mg/100 g，而膽固醇和植物甾醇的結(jié)構(gòu)相似，因此在色譜圖上也會(huì)出現(xiàn)牛奶自身含有的膽固醇，因此在計(jì)算植物甾醇（以總甾醇計(jì)）含量時(shí)，應(yīng)將膽固醇含量去除。

2）植物甾醇種類較多，而其他種類甾醇含量較低且缺乏標(biāo)準(zhǔn)樣品，因此本方法所測(cè)定的植物甾醇不包含全部甾醇，是以牛乳中含量較高的β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇4種甾醇進(jìn)行定量。如要測(cè)定牛乳中所含有的全部植物甾醇含量，需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

[1] 韓軍花,楊月欣.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應(yīng)用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2001,28(5):285-291

[2]Lena Normen,Susanne Bryngelsson,Monica Johnsson.The phytosterols content of some cereal food commonly consumed in Sweden and in the Netherlands[J].Journal of Food Composition and Analysis, 2002,15:693-704

[3]Vieno Piironen,Jari Toivo,Riitta Puupponen-Pimia.Plant sterols in vegetables,fruits and berries[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2003,83:330-337

[4]Jari Toivo,Katherine Phillips,Anna-Maija Lampi.Determination of sterols in foods:recovery of free,esterifiedand glycosidic sterols[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2001,14:631-643

[5]鮑忠定,許榮年,張頌紅.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定油中植物甾醇和膽固醇[J].分析化學(xué),2002,30(12):1490-1493

[6] 尹鍵,魏萬(wàn)之,鐘科軍,等.氣相色譜法側(cè)定煙草中的β-谷甾醇[J].湖南大學(xué)學(xué)報(bào),2000,27(6):22-27

[7]王江,昊榮,王辛.GC-測(cè)定靈芝中植物菌醉的含量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢臉雜志,2004,14(2):217

[8]馮妹元,韓軍花,劉成梅,楊月欣.常見(jiàn)精練油中植物甾醇測(cè)定方法的建立及含量分析[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2006,18(3):197-201

Determination of Four Types Plant Sterol in Modified Milk with Gas Chromatography

YAN Ning-huan1，CHEN Wei2，*，QIAN Wen-tao2，JI Guo-zhi2，LI Hong-liang2，MU Zhi-shen2
（1.Inner Mongolia vocational Institute of Chemical Technology，Hohhot 011503，Inner Mongolia，China；2.Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering，Hohhot 011500，Inner Mongolia，China）

To research the sensitive method of determine the content of plant sterol in modified milk.Samples was disposed with hydroxide ultrasonic for 15 min in 2 mol/L ethanol potassium，and stayed it in 60℃water bath for 45 min，then extracting Plant sterol from liquid Heptanes，and then deriving through the Pyridine and MSTFA in 80℃water bath for 10 min.Finally，the sample was determined by Gas Chromatography.With this method，the total content of plant sterols was 170 mg/100 g，the average recovery of the standard（stigma sterol）was 86.59%-103.09%.This method was simple and accurate with high sensitivity.

modified milk；β-sitosterol；brassicasterol；campestrol；stigmasterol；Gas chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.029

2013-03-19

閆寧環(huán)（1980—），女（漢），講師，碩士，從事乳及乳制品生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)及成分研究的工作。

*通信作者：陳偉（1980—），男（漢），工程師，碩士，從事乳及乳制品生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)及成分研究的工作。