李 祥， 種亞莉， 曹江絨

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.北京弘祥隆生物科技股份有限公司, 北京 100085)

0 引言

葉綠素屬于卟啉類化合物[1]，是重要的天然色素，廣泛存在于植物和某些動(dòng)物體內(nèi)，常作為著色劑或添加劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域[2-4].大多數(shù)葉綠素從綠色植物中提取，但成本較高.我國(guó)養(yǎng)蠶歷史悠久，是世界蠶業(yè)的發(fā)源地和主產(chǎn)國(guó)[5,6]，研究表明，蠶沙中葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.8%～1.0%，高于綠色植物中的含量[7].但由于葉綠素的穩(wěn)定性差，故將葉綠素合成其衍生物，如葉綠素鐵鈉鹽[8]、葉綠素鋅鈉鹽[9]、葉綠素銅鈉鹽[10,11]等.目前，利用蠶沙制備葉綠素鐵鈉鹽的研究較少，故研究蠶沙葉綠素鐵鈉鹽的制備工藝有一定的經(jīng)濟(jì)效益.

葉綠素鐵鈉鹽是一種帶胺味的墨綠色結(jié)晶性粉末，在食品方面，用作食品添加劑、染色劑、脫臭劑；在醫(yī)療方面，由于葉綠素鐵鈉鹽的結(jié)構(gòu)和人體血紅蛋白的結(jié)構(gòu)非常相似，故在人體中的生物利用率很高，可作為缺鐵性貧血治療的輔助藥品[8].近年來，發(fā)現(xiàn)葉綠素鐵鈉具有抗菌、抗病毒、抗過敏和促進(jìn)組織再生等作用，是一種良好的造血細(xì)胞復(fù)合劑，對(duì)各種原因引起的白細(xì)胞減少癥及各種貧血有治療作用[12].

傳統(tǒng)葉綠素鐵鈉鹽的制備是先用有機(jī)溶劑提取葉綠素然后濃縮再皂化[13-15]，工藝路線較長(zhǎng)，成本高，為了克服這一缺點(diǎn).本研究將葉綠素的提取與皂化合并，探討了直接皂化法制備葉綠素鐵鈉鹽的最優(yōu)工藝條件，并且與傳統(tǒng)的工藝進(jìn)行比較說明了直接皂化法是可行的.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

蠶沙，購于陜西安康旬陽；95%乙醇，氫氧化鈉，石油醚，硫酸，硫酸亞鐵，無水乙醇均為分析純，購于西安化學(xué)試劑有限公司.

1.2 主要儀器

FZ102型植物試樣粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；7230G型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；R201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；TDL-40B型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHB-B 95型循環(huán)式多用真空泵，陜西太康生物科技有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葉綠素的測(cè)定

準(zhǔn)確移取0.5 mL萃取除雜后的皂化液，用95%乙醇定容至10 mL，分別測(cè)定649 nm和665 nm處的吸光度A.按如下公式計(jì)算葉綠素提取率[16].

葉綠素a的質(zhì)量濃度

ρa(bǔ)=13.95A665-6.88A649.

葉綠素b的質(zhì)量濃度

ρb=24.96A649-7.32A665.

葉綠素總的質(zhì)量濃度

ρ總=ρa(bǔ)+ρb.

葉綠素提取率=ρ總×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量

1.3.2 直接皂化條件的確定

(1)體系pH的確定

稱取6份10 g干蠶沙粉分別于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min，軟化完后加入100 mL95%乙醇，分別用10%NaOH調(diào)節(jié)體系pH為8、9、10、11、12、13，之后將其同時(shí)放置在KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器中并設(shè)置超聲時(shí)間為120 min，超聲溫度為70 ℃，待其超聲結(jié)束，測(cè)定溶液中葉綠素的含量.

(2)超聲時(shí)間的確定

稱取6份10 g干蠶沙粉分別于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min，軟化完后加入100 mL95%乙醇，用10%NaOH調(diào)節(jié)體系pH為12，之后將其分別放置在超聲時(shí)間為60、80、100、120、150、180 min，超聲溫度為70 ℃的KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器中，待其超聲結(jié)束，測(cè)定溶液中葉綠素的含量.

(3)超聲溫度的確定

稱取6份10 g干蠶沙粉分別于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min，軟化完后加入100 mL95%乙醇，用10%NaOH調(diào)解體系pH為12，之后將其分別放置在超聲時(shí)間為120 min，超聲溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器中，待其超聲結(jié)束，測(cè)定溶液中葉綠素的含量.

1.3.3 酸化置鐵條件的確定

(1)置鐵量的確定

取6份100 mL皂化液分別于250 mL的三口燒瓶中，連接攪拌裝置，開啟電動(dòng)攪拌器，用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)體系pH至2～3，酸化30 min后至皂化液完全成褐色，在此酸性條件下分別加入2、3、4、5、6、7 mL的10% FeSO4，調(diào)節(jié)水浴溫度為65 ℃，反應(yīng)120 min，待反應(yīng)完全，靜置、冷卻后加等量蒸餾水，過濾得葉綠素鐵酸，將所得葉綠素鐵酸溶解在丙酮中，加10% NaOH-乙醇溶液調(diào)節(jié)pH在11～12，此時(shí)出現(xiàn)墨綠色的晶體，靜置片刻用離心機(jī)常溫離心，60 ℃烘干得墨綠色葉綠素鐵鈉鹽.

(2)置鐵時(shí)間的確定

取6份100 mL皂化液分別于250 mL的三口燒瓶中，連接攪拌裝置，開啟電動(dòng)攪拌器，用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)體系pH至2～3，酸化30 min后至皂化液完全成褐色，在此酸性條件下加入6 mL的10%FeSO4，調(diào)節(jié)水浴溫度為65 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，待反應(yīng)完全，靜置、冷卻后加等量蒸餾水，過濾得葉綠素鐵酸，將所得葉綠素鐵酸溶解在丙酮中，加10%NaOH-乙醇溶液調(diào)節(jié)pH在11～12，此時(shí)出現(xiàn)墨綠色的晶體，靜置片刻用離心機(jī)常溫離心，60 ℃烘干得墨綠色葉綠素鐵鈉鹽.

(3)置鐵溫度的確定

取6份100 mL皂化液分別于250 mL的三口燒瓶中，連接攪拌裝置，開啟電動(dòng)攪拌器，用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)體系pH至2～3，酸化30 min后至皂化液完全成褐色，在此時(shí)的酸性條件下加入6 mL的10% FeSO4，調(diào)節(jié)水浴溫度分別為50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃，反應(yīng)時(shí)間為120 min，待反應(yīng)完全，靜置、冷卻后加等量蒸餾水，過濾得葉綠素鐵酸，將所得葉綠素鐵酸溶解在丙酮中，加10%NaOH-乙醇溶液調(diào)節(jié)pH在11～12，此時(shí)出現(xiàn)墨綠色的晶體，靜置片刻用離心機(jī)常溫離心，60 ℃烘干得墨綠色葉綠素鐵鈉鹽.

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交法在四因素三水平上主要考察體系pH、超聲溫度、置鐵時(shí)間、置鐵量對(duì)葉綠素鐵鈉鹽制備的影響，探索蠶沙葉綠素鐵鈉鹽制備的最優(yōu)工藝，試驗(yàn)安排如表1所示.

表1 因素水平

1.4 對(duì)照試驗(yàn)

傳統(tǒng)制備法見參考文獻(xiàn)[15].

直接皂化法：稱取干蠶沙粉10 g，于250 mL燒杯中加入15 mL蒸餾水軟化20 min，軟化完后加入95%乙醇100 mL，并用10% NaOH調(diào)節(jié)使體系pH≈12，放置在KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器中，將其設(shè)置為超聲時(shí)間120 min，超聲溫度70 ℃.待其超聲結(jié)束后，用等量石油醚萃取三次，收集下層萃取液待用.將萃取液轉(zhuǎn)入250 mL三口燒瓶中用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)體系使pH≈2～3，65 ℃下酸化30 min，加入6 mL10% FeSO4溶液，置鐵時(shí)間150 min，最后用10% NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液使葉綠素鐵酸成鹽析出.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1.1 直接皂化條件的確定

按1.3.2中的(1)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

圖1 體系pH對(duì)皂化反應(yīng)的影響

由圖1可知，體系pH在8～12，皂化液中葉綠素含量迅速降低；體系pH在12～13，皂化液中葉綠素含量基本不變.原因可能是：此時(shí)被萃取出來的葉綠素參與皂化反應(yīng)且皂化反應(yīng)已經(jīng)基本達(dá)到了平衡.因此，試驗(yàn)結(jié)果表明：體系維持在pH≈12為宜.

按1.3.2中的(2)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 超聲時(shí)間對(duì)皂化反應(yīng)的影響

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)皂化液中葉綠素含量逐漸降低，大部分葉綠素已被皂化.反應(yīng)時(shí)間在60～120 min之間時(shí)，葉綠素含量降低較快，120～180 min之間時(shí)，葉綠素含量降低趨于平緩.原因可能是：①皂化反應(yīng)本身就是一個(gè)可逆反應(yīng)，在某一時(shí)間會(huì)達(dá)到平衡狀態(tài)，在該試驗(yàn)中超聲時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)皂化反應(yīng)即達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，對(duì)葉綠素鐵鈉鹽的產(chǎn)率影響并不明顯.②葉綠素不穩(wěn)定，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)葉綠素在堿性和溫度比較高的條件下會(huì)分解.所以120～180 min之間葉綠素的緩慢降低是由于葉綠素被氧化分解變性了，因此，超聲時(shí)間以120 min為宜.

按1.3.2中的(3)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

圖3 超聲溫度對(duì)皂化反應(yīng)的影響

由圖3可知，隨著超聲溫度的增加皂化液中的葉綠素含量逐漸降低，當(dāng)超聲溫度超過70 ℃時(shí)，皂化液中的葉綠素降低趨于平緩，原因可能是：溫度升高，動(dòng)態(tài)反應(yīng)平衡向右移動(dòng)，而70 ℃時(shí)反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)繼續(xù)增加超聲溫度皂化液中葉綠素含量基本不變而且還會(huì)使葉綠素降解.因此，超聲溫度以70 ℃為宜.

2.1.2 酸化置鐵條件的確定

按1.3.3中的(1)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.

圖4 置鐵量對(duì)置鐵反應(yīng)的影響

由圖4可知，隨著10% FeSO4量的增加，葉綠素鐵鈉鹽的含量也在增加，當(dāng)10% FeSO4增加到6 mL時(shí)葉綠素鐵鈉鹽的產(chǎn)量達(dá)到最大且繼續(xù)增加10% FeSO4葉綠素鐵鈉鹽的產(chǎn)量基本不變，這是由于能夠和鐵離子絡(luò)合的脫鎂葉綠素是有限的，當(dāng)達(dá)到一定程度就不再絡(luò)合，此時(shí)繼續(xù)加入鐵鹽，鐵離子只能以游離態(tài)存在于溶液中，不僅增加成本而且還對(duì)后期污水的處理增加工作量，所以加入鐵鹽以6 mL為最佳.

按1.3.3中的(2)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.

圖5 置鐵時(shí)間對(duì)置鐵反應(yīng)的影響

由圖5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)葉綠素鐵鈉鹽的產(chǎn)量逐漸增加，但當(dāng)超過120 min后，葉綠素鐵鈉鹽的產(chǎn)量反而降低.這是由于在酸化置鐵反應(yīng)過程中溶液中的溶劑在慢慢蒸發(fā)，隨著反應(yīng)的延長(zhǎng)蒸發(fā)的溶劑也就越多，生成的葉綠素鐵酸的濃度也就變的越大，會(huì)將原本在120 min處的反應(yīng)平衡打破，使酸化置鐵反應(yīng)逆向進(jìn)行，從而導(dǎo)致生成的葉綠素鐵酸含量降低，因此，置鐵時(shí)間以120 min為宜.

按1.3.3中的(3)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示.

圖6 置鐵溫度對(duì)置鐵反應(yīng)的影響

由圖6可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，葉綠素鐵鈉鹽的產(chǎn)量逐漸增加，但當(dāng)超過65 ℃時(shí)，葉綠素鐵鈉鹽的產(chǎn)量反而降低.原因可能是：①隨著溫度的升高溶劑的揮發(fā)，會(huì)使生成的葉綠素鐵酸的濃度也增大，該置鐵反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，產(chǎn)物濃度增大會(huì)使反應(yīng)逆向進(jìn)行，從而使已經(jīng)生成的葉綠素鐵酸又被分解；②葉綠素鐵酸的溶解度隨著溫度的升高而增大，溫度過高不能使葉綠素鐵酸完全析出來，而是溶解在溶液里.所以，綜合考慮選取65 ℃為酸化置鐵最優(yōu)溫度.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與討論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮主要因素對(duì)葉綠素鐵鈉鹽產(chǎn)率的影響，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示.

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

由表2的極差分析可知，影響葉綠素鐵鈉鹽制備諸因素的主次關(guān)系為體系pH﹥置鐵時(shí)間﹥置鐵量﹥超聲溫度.制備葉綠素鐵鈉鹽的最優(yōu)條件為加堿使皂化體系pH≈12，置鐵時(shí)間為150 min，置鐵量為6 mL，超聲溫度為80 ℃.

2.3 對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果

按照1.4進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示.

表3 對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，直接皂化法葉綠素鐵鈉鹽的得率大于傳統(tǒng)制備法葉綠素鐵鈉鹽的得率，而且直接皂化法比傳統(tǒng)制備法在制備工藝上還少一道工序，因此直接皂化法是可行的.

3 產(chǎn)品分析

3.1 產(chǎn)品性狀

本法制備的葉綠素鐵鈉鹽為墨綠色具有金屬光澤的粉末，易溶于水，水溶液透明無沉淀，微溶于乙醇，氯仿，不溶于乙醚.

3.2 光譜分析

配制0.01%的葉綠素鐵鈉鹽溶液，用7230G紫外-可見分光光度計(jì)掃描其吸收光譜，在405 nm和655 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，與傳統(tǒng)制法得到的葉綠素鐵鈉鹽的波長(zhǎng)一致[13].結(jié)果如圖7所示.

圖7 葉綠素鐵鈉鹽紫外吸收光譜圖

4 結(jié)論

本文探討了體系pH、超聲時(shí)間、超聲溫度、置鐵量、置鐵時(shí)間、置鐵溫度對(duì)葉綠素鐵鈉鹽產(chǎn)率的影響，得到直接皂化法制備葉綠素鐵鈉鹽的最優(yōu)條件.直接皂化法將葉綠素的提取與皂化合并，在提取葉綠素的溶液體系中直接加入堿，給定一定的溫度、一定的時(shí)間，使萃取出來的葉綠素直接皂化，比傳統(tǒng)的先提取葉綠素再皂化制備葉綠素鐵鈉鹽少了一道工序，為其工業(yè)化生產(chǎn)節(jié)約了成本，使得葉綠素鐵鈉鹽的制備從理論向?qū)嶋H又邁進(jìn)了一步.

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