潘嘉慧 田 峻 沈國權(quán) 趙亮亮 朱海云

（佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東佛山 528225）

膠體金免疫層析法快速測(cè)定動(dòng)物源食品中的呋喃唑酮代謝物殘留

潘嘉慧 田 峻 沈國權(quán) 趙亮亮 朱海云

（佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東佛山 528225）

本研究從優(yōu)化呋喃唑酮代謝物免疫抗原、包被抗原的結(jié)構(gòu)及優(yōu)化偶聯(lián)技術(shù)角度出發(fā)，提高呋喃唑酮抗體的特異性、親和力，并通過優(yōu)化樣品前處理步驟，最終得到呋喃唑酮代謝物膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)低限為1.0 μg/kg，特異性好，穩(wěn)定性高。

呋喃唑酮代謝物；抗原；免疫膠體金；快速檢測(cè)

呋喃唑酮是硝基呋喃類廣譜抗生素中最具代表性的一種，價(jià)格便宜，療效確切，在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖上應(yīng)用非常廣泛[1]。呋喃唑酮在生物體內(nèi)代謝速率很快，代謝化合物3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）可在體內(nèi)殘留達(dá)數(shù)周之久，甚至進(jìn)入食物鏈中，在自然環(huán)境中長(zhǎng)期殘留。研究表明呋喃唑酮及其代謝物AOZ具有相當(dāng)大的毒性和副作用，因而引起了人們的高度重視[2]，導(dǎo)致各國禁止此類藥物在治療和飼料中使用。歐盟、美國、中國等國家均將呋喃唑酮列為禁用藥。盡管我國政府和相關(guān)組織對(duì)該類藥物的殘留給予了高度重視，但其在動(dòng)物源性食品中的殘留仍時(shí)有發(fā)生。

目前對(duì)呋喃唑酮代謝物的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法有色譜分析法[3]、免疫檢測(cè)法（酶聯(lián)免疫分析方法[4]）。色譜分析法（高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法）樣品前處理復(fù)雜，費(fèi)用高；免疫分析法具有快速、靈敏度高、高通量的特點(diǎn)。其中免疫分析方法有酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析技術(shù)等。酶聯(lián)免疫分析法操作相對(duì)繁瑣，對(duì)操作人員的專業(yè)知識(shí)要求較高，相比之下，膠體金免疫層析技術(shù)基于肉眼水平的檢測(cè)，不需任何儀器設(shè)備和試劑，比酶聯(lián)免疫法省略了加顯色劑和終止液的步驟，更簡(jiǎn)化的操作，體積小，易攜帶，幾分鐘就可用肉眼觀察到顏色鮮明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并可保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，容易在基層單位普及應(yīng)用。

現(xiàn)有免疫檢測(cè)方法均需要將樣品用對(duì)硝基苯甲醛[3]、對(duì)羧基苯甲醛[4]衍生化，在AOZ檢測(cè)的靈敏度和特異性還是存在缺陷，因而，有必要在現(xiàn)有技術(shù)上，從優(yōu)化免疫抗原、包被抗原的結(jié)構(gòu)及偶聯(lián)技術(shù)角度出發(fā)，提高抗體的特異性、親和力，從而增加AOZ免疫膠體金快速檢測(cè)的靈敏度和特異性。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

AOZ、氯金酸、檸檬酸三鈉、6-氧代己酸、甲基磺酸、二甲基甲酰胺（Nimethylformamide，DMF）、3-磷酰化二苯酯苯并[D]噁唑-2-酮[2（3H）- Benzoxazolone，3-（diphenoxyphosphinyl）-（9CI），DPBO]、苯并噻唑硫酮（Benzothiazolethione，BTT）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）：美國Sigma公司；羊抗鼠IgG、硝酸纖維素膜（NC膜）和金標(biāo)墊，樣品墊，PVC底板，吸水紙：上海杰一生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti 高速冷凍離心機(jī)：美國Beckman公司；UV-2700紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Ultra Genetic超純水系統(tǒng)：英國ELGA公司；JY-EQ08劃膜噴金一體機(jī)：上海杰一生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 縮醛法合成AOZ半抗原

將200ml乙醇加入到500ml的圓底燒瓶中，依次加入AOZ（圖1中結(jié)構(gòu)式a，10.2g，0.1mol）和6-氧代己酸（15.6g，0.12mol），加熱回流3h。停止加熱，自然冷卻反應(yīng)液至室溫，靜置過夜。抽濾，濾餅用乙醇洗滌（20.0ml×3），50℃干燥5h后得到20.4g含有羧基的呋喃唑酮衍生物。制備的AOZ半抗原（圖1中結(jié)構(gòu)式b）

1.3.2 活潑硫酯法合成AOZ免疫抗原和包被抗原

取呋喃唑酮半抗原（圖1中結(jié)構(gòu)式b，0.214g，1.0mmol）溶于30ml DMF中，冷卻至0～4℃，攪拌下加入DPBO（0.351g，1.0mmol）和BTT（0.167g，1.0mmol），保溫反應(yīng)過夜。加入100ml 10%碳酸氫鈉溶液和100ml水，繼續(xù)攪拌1h，抽濾，濾餅用水洗滌（50mL×2）后用20ml DMF溶解為A液。稱取2.0g BSA溶于200ml的濃度為1.0mol/L的PBS（pH=8）中，加入5ml DMF，在0～5℃下攪拌溶解為B液，將上述A液緩慢滴加到B液中，保溫反應(yīng)8h，離心取上清液，4℃下用生理鹽水恒溫透析3d，每天更換3次透析液，冷凍干燥后得到呋喃唑酮免疫原（圖1中結(jié)構(gòu)式c）。

圖1 AOZ免疫抗原/包被抗原的合成路線圖

1.3.3 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的制備

用AOZ免疫抗原多次免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）在體外融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選，得到陽性雜交瘤細(xì)胞株。將其注入小鼠腹腔獲取腹水，或利用體外細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清液等方式，制備AOZ單克隆抗體。用硫酸銨沉淀法純化該抗體，并與等體積甘油混合，低溫保存。

1.3.4 羊抗鼠IgG的制備

以上述步驟1.3.3制備的鼠源抗體為免疫原，對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠IgG。

1.3.5 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金：于100ml超純水中加入1ml 1%的檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入1ml 1%氯金酸溶液，待溶液顏色變?yōu)槌吻寰萍t色時(shí)，繼續(xù)加熱10min，冷卻至室溫后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 膠體金標(biāo)記呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的制備

量取膠體金溶液10ml，將其pH值調(diào)整到7.8，攪拌并加入AOZ單克隆抗體0.8mg進(jìn)行標(biāo)記，持續(xù)攪拌30min后，加入20%的BSA終止反應(yīng)，10000 rpm離心30min，取沉淀用金標(biāo)緩沖液溶解至1ml備用。

1.3.7 膠體金免疫層析試紙條的制備和組裝

使用劃膜噴金一體機(jī)將制備好的金標(biāo)抗體均勻噴涂到金標(biāo)墊上，噴金參數(shù)4μl/cm，37℃真空干燥8h備用。將適當(dāng)濃度的包被抗原（AOZ-OVA偶聯(lián)物）包被到NC膜的檢測(cè)線（T線）位置，羊抗鼠IgG包被到質(zhì)控線（C線）位置，包膜參數(shù)1.0μL/cm，晾干備用。將干燥好的樣品墊，金標(biāo)墊，NC膜，吸水紙，按順序粘貼到PVC底板上，切割成條，組裝成卡，分裝到鋁箔袋，袋內(nèi)裝入干燥劑，密封保存。

1.3.8 樣品前處理、檢測(cè)及判讀

（1）樣品前處理

①雞肉、豬肉、蝦肉、魚肉組織：取2g待測(cè)樣品，用均質(zhì)器充分均質(zhì)后，置于50ml離心管中。加入4ml去離子水，0.5ml 1mol/ L鹽酸溶液，200μL 0.01mol/L對(duì)羥基苯甲醛或鄰氨基苯甲醛，渦旋震蕩3min，在60℃中放置2h或超聲1h。取出冷卻至室溫，依次加入5ml 0.1mol/L 磷酸氫二鉀溶液，0.4ml 1mol/L氫氧化鈉溶液，5ml乙酸乙酯，渦旋振蕩1min，4000r/min 離心10min，將上層乙酸乙酯層提取液取至另一潔凈容器中，水相再用5ml乙酸乙酯重復(fù)萃取兩次，合并乙酸乙酯層，于60℃下氮?dú)獯蹈桑尤?ml 正己烷渦旋震蕩1min，再加入1ml 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液，渦旋震蕩1 min，5000r/min離心10min，吸取下層水相溶液用于分析，或繼續(xù)使用C18固相萃取柱凈化。

②牛奶：取5ml待測(cè)樣品于50ml 離心管中。加入250μl 0.5 mol/L亞硝基鐵氰化鉀（K2Fe（CN）5·NO3·H2O）水溶液，250μl 1 mol/L 硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）水溶液，渦旋震蕩1min，4℃下4000 r/min離心10min，取上清液，以下步驟同上。

③蜂蜜：取2g 待測(cè)樣品于50ml 離心管中，以下步驟同上。（2）樣品檢測(cè)

撕開鋁箔包裝，取出檢測(cè)卡。取滴兩滴檢體（約75μL）于加樣孔中，等待檢體吸附移動(dòng)至測(cè)試區(qū)中，等待5min后即可判讀結(jié)果。

（3）結(jié)果判讀

①陰性結(jié)果：T線比C線深或一樣深，表示檢品AOZ濃度低于1.0 μg/kg。

②陽性結(jié)果：T線比C線淡或幾乎看不見，表示檢品AOZ濃度高于或等于1.0 μg/kg（包括看不到T線）。

③無效結(jié)果：如果測(cè)試結(jié)果未出現(xiàn)任何色帶或是C線未出現(xiàn)，此時(shí)表示此試劑已失效、過期或操作不當(dāng)，需另做一次測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 AOZ半抗原、免疫原/包被原的制備

AOZ的分子較小，不具有免疫原性，需要與載體蛋白偶聯(lián)后方能具有免疫原性；然而AOZ是一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)上沒有羧基和氨基的半抗原，它本身無法與蛋白偶聯(lián)，而往往需要合成其他衍生物作為半抗原，然后與載體蛋白偶聯(lián)才能成為全抗原。

本研究特別從半抗原、免疫原/包被原的結(jié)構(gòu)出發(fā)，采用全新的連接臂，優(yōu)化偶聯(lián)技術(shù)和合成路線，同時(shí)保證檢測(cè)特異性和靈敏度。本研究中的AOZ半抗原保留了AOZ的抗體識(shí)別部位：對(duì)硝基苯基部分，從遠(yuǎn)離特征結(jié)構(gòu)、免疫原性最弱的羥基端引入間隔臂，提高了半抗原的免疫原性，同時(shí)保留AOZ的骨架結(jié)構(gòu)，提高特異性，確保半抗原不受蛋白的屏蔽作用；引入的間隔臂具有一定的長(zhǎng)度和適當(dāng)?shù)臉O性，將載體蛋白對(duì)小分子的電子排布和空間結(jié)構(gòu)的影響降到最低；合成的半抗原有利于提高半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比，并且能更好地暴露半抗原的抗原決定簇。在免疫分析中，通過對(duì)半抗原連接位點(diǎn)，連接臂長(zhǎng)度，結(jié)構(gòu)等進(jìn)行合理選擇與搭配，可以有效地利用可預(yù)測(cè)的交叉反應(yīng)，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)某一族化合物的目的，并且可以抑制不可預(yù)測(cè)的交叉反應(yīng)，提高檢測(cè)的特異性[5]。

2.2 膠體金納米顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

膠體金納米顆粒的粒徑大小與膠體金探針穩(wěn)定性密切相關(guān)。將制備好的膠體金溶液經(jīng)紫外-可見光分光光度計(jì)在400～700nm波長(zhǎng)處掃描，測(cè)定吸收?qǐng)D譜，結(jié)果顯示，膠體金溶液在525nm出現(xiàn)最大吸收峰，OD525nm=1.82，顆粒大小約為30nm，符合膠體金免疫層析法中膠體金顆粒大小的要求。

2.3 抗原包被濃度的優(yōu)化

以AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5μg/L進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化調(diào)整抗原的包被濃度。分別選擇包被濃度為0.70，0.75，0.80，0.85mg/mL進(jìn)行測(cè)試選擇。取75μL AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品孔中，溶液沿吸水紙方向移動(dòng)。首先與金標(biāo)墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合，并一同繼續(xù)向吸水紙方向移動(dòng)，到達(dá)T線區(qū)域。在T線處，溶液中的AOZ與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)抗體，溶液中的AOZ濃度一定，則包被抗原濃度越大，能夠與包被抗原相結(jié)合的金標(biāo)抗體的量越多，膠體金的顏色（紅色）越深。隨著包被濃度的增大，T線顏色越深，到0.80mg/mL達(dá)到最佳濃度，濃度再增加時(shí)顏色基本不變，因此確定最佳膜包被濃度為0.8mg/ml。

2.4 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)AOZ的檢出限

配制濃度為0.5，0.8，1.0μg/L AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液。取75μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品墊中，層析結(jié)束后觀察結(jié)果。結(jié)果表明，隨著AOZ的濃度升高，在C線區(qū)膠體金顏色強(qiáng)度相對(duì)增大，在T線區(qū)膠體金顏色則逐漸變淺，在0.8μg /L時(shí)T線顏色明顯變淺，在1.0μg/L時(shí)T線顏色完全消失。則將T線顏色基本完全消失所對(duì)應(yīng)的濃度定義1.0μg/L為膠體金免疫層析法的檢出限，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法中使用色譜檢測(cè)的測(cè)定低限相當(dāng)[3-4]，但相比之下膠體金檢測(cè)試紙條的價(jià)格等優(yōu)勢(shì)不言而喻，且滿足歐盟2003/181/EC法令規(guī)定限量的檢測(cè)要求：呋喃唑酮代謝物AOZ在豬肉和水產(chǎn)品中的最大允許限量（MPRL）為1.0μg /kg。

2.5 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)AOZ的特異性

抗體的特異性是衡量抗體質(zhì)量的重要指標(biāo)。選取了3種AOZ結(jié)構(gòu)相似物（呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林代謝物）進(jìn)行特異性試驗(yàn)，添加濃度均為10μg/L，T線顯色明顯，即均為陰性，而AOZ陽性對(duì)照試液只有C線顯色，T線不顯色，顯示為強(qiáng)陽性，表明本試驗(yàn)研制的AOZ膠體金試紙條特異性表現(xiàn)良好，與測(cè)試的3種類似物均沒有交叉反應(yīng)現(xiàn)象。

近年來膠體金免疫層析技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品安全快速診斷領(lǐng)域。本研究通過優(yōu)化偶聯(lián)技術(shù)路線，以達(dá)到結(jié)構(gòu)優(yōu)化，提高抗體質(zhì)量，從而進(jìn)一步增加AOZ免疫膠體金快速檢測(cè)的靈敏度和特異性的免疫抗原和包被抗原。本實(shí)驗(yàn)成功研制出AOZ快速檢測(cè)試紙條，靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，除了樣本預(yù)處理外的測(cè)試時(shí)間僅需五分鐘，與ELISA方法相比，快速、簡(jiǎn)便、成本低，可操作性強(qiáng)，為廣大的動(dòng)物源性食品加工企業(yè)、檢測(cè)部分現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等提供了一種有效、便利的方法，值得推廣。

[1] 陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[2] Kelly B D，Heneghan M A，Connolly C E，et al. Nitrofurantoininduced hepatoxicity mediated by CD8+T cells[J]. American Journal of Gastroenterology，1998，93（5）：819-821.

[3] Chappey ON，Sandouk P，Scherrmann J G. Monochonal antibodies in hapten immunoassays. Pharmaceutical Research，1992，9（11）：1375-1379.