劉明春

（廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校，廣西柳州 545003）

奶牛隱性乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

劉明春

（廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校，廣西柳州 545003）

導(dǎo)致奶牛隱性乳房炎的因素很多，但病原微生物是導(dǎo)致隱性乳房炎的主要病因[1]，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，但各地病原感染情況不盡相同。本試驗(yàn)通過對(duì)柳州市部分奶牛場(chǎng)采集奶樣進(jìn)行細(xì)菌的分離及藥敏試驗(yàn)，為奶牛隱性乳房炎的防治、用藥提供可靠依據(jù)，以促進(jìn)柳州市奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基的制備

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、血清肉湯、生化培養(yǎng)基及試劑按常規(guī)方法配制。無菌將牛鮮血以5～7%的比例加入消毒好的30～40℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中。各培養(yǎng)基分別傾注于平皿，冷卻后置于冰箱備用。生化鑒定所用的微量發(fā)酵管購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 試劑

診斷液（LMT）：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸醫(yī)研究所研制產(chǎn)品。革蘭氏染色液：廣西大學(xué)臨床教學(xué)研究室提供。

1.1.3 藥敏試紙紙片

青霉素、鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、林可霉素、克林霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐和紅霉素，購(gòu)自上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所。

其它器材：超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、高壓滅菌鍋、顯微鏡、試管等。

1.2 中藥準(zhǔn)備

方劑由黃芪、蒲公英、金銀花、當(dāng)歸、川芎、熟地、王不留行、木芙蓉、黨參、杜仲葉、山豆根、甘草等十幾種中藥組成，購(gòu)自柳州市醫(yī)藥公司。按復(fù)方比例稱取中藥，加5～10倍水武火加熱至沸后文火維持30min，四層紗布過濾。濾渣按上述方法再煎煮1次，合并2次濾液，濃縮至50ml，備用。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

選擇經(jīng)LMT診斷為陽性的柳州市某奶牛場(chǎng)的50頭奶牛，每頭奶牛取乳樣5ml于無菌乳樣杯中，作好標(biāo)記，待檢。每個(gè)離心管放5ml奶樣，2000～3000rpm離心10min，棄去管中的上層液體，留取底部沉淀物，無菌操作吸取沉淀物0.1ml，分別接種于綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊指、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、改良愛德化瓊脂、卻曼瓊脂平皿，并接種營(yíng)養(yǎng)肉湯兩管（一管為營(yíng)養(yǎng)肉湯，另一管添加10%血清），37℃培養(yǎng)24h，挑取菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。根據(jù)菌體形態(tài)、溶血情況及染色特性判定細(xì)菌類屬[2]。各類細(xì)菌按相應(yīng)生化特性作進(jìn)一步鑒定[3。

1.4 藥敏試驗(yàn)

1.4.1 西藥藥敏試驗(yàn)

選擇從乳樣中分離出的典型菌株－金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌分別均勻劃線接種于血瓊脂平皿，以紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。

所選抗菌藥物有：恩諾沙星、諾氟沙星、慶大霉素和阿米卡星、林可霉素、克林霉素和頭孢氨芐、青霉素G、鏈霉素、四環(huán)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

50個(gè)乳樣全部檢出了10種81個(gè)菌株，其中葡萄球菌45株，占55.56%；鏈球菌19株（無乳鏈球菌7株、停乳鏈球菌6株、乳房鏈球菌4株、乳鏈球菌1株、糞鏈球菌1株），占23.46%；大腸桿菌11株，占13.58%；克雷伯氏菌3株，占3.70%；志賀桿菌3株，占3.70%。由葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌引起的隱性乳房炎占整個(gè)比例的92.59%（表1）。單純由某一種病原菌引起的占30%，由2～3種甚至是3種以上的病原菌引起的占占70%，混合感染的情況比較嚴(yán)重。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，葡萄球菌對(duì)恩諾沙星、阿米卡星和慶大霉素高度敏感，對(duì)林可霉素、克林霉素、四環(huán)素、諾氟沙星和頭孢氨芐比較敏感；鏈球菌則對(duì)阿米卡星、克林霉素、恩諾沙星、林可霉素和慶大霉素高度敏感，對(duì)諾氟沙星、四環(huán)素比較敏感，對(duì)頭孢氨芐不敏感；大腸桿菌對(duì)恩諾沙星、頭孢氨芐、阿米卡星、慶大霉素和克林霉素高度敏感，對(duì)諾氟沙星、林可霉素比較敏感，對(duì)四環(huán)素不敏感。金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌分別對(duì)青霉素、鏈霉素、紅霉素已產(chǎn)生耐藥性。中藥復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球菌與鏈球菌較為敏感，而對(duì)大腸桿菌則為高度敏感（表1）。

表1 各藥對(duì)3種病原菌的抑菌圈直徑（mm）

3 討論

3.1 本地區(qū)奶牛隱性乳房炎的病原

通過對(duì)50個(gè)陽性乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，共得到10種81個(gè)菌株。其中葡萄球菌的分離率最高，為55.56%，鏈球菌占23.46%，大腸桿菌占13.58%。說明柳州市部分奶牛場(chǎng)奶牛隱性乳房炎以葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主要病原菌，占92.59%。而且以素和紅霉素共11種常用抗菌藥。

抗菌效果判定：青霉素G和頭孢氨芐對(duì)葡萄球菌的抑菌圈直徑≥29mm為敏感，≤28mm為不敏感；對(duì)鏈球菌抑菌圈直徑≥28mm為敏感，≤19mm為不敏感；其它藥物抑菌圈直徑≥20mm為高敏；15～20mm為中敏；≤15mm為不敏感。

1.4.2 中藥抑菌試驗(yàn)

用平板法，取各菌液200μl均勻涂于瓊脂板上，然后在平板上打孔，封底，每孔中注滿藥液，重復(fù)3孔，測(cè)量抑菌圈直徑。2～3種病原菌感染為主，混合感染相當(dāng)嚴(yán)重，可能這與牛場(chǎng)的消毒衛(wèi)生管理不嚴(yán)有一定的關(guān)系。強(qiáng)化衛(wèi)生意識(shí)，加強(qiáng)擠奶過程的各項(xiàng)衛(wèi)生管理，改善牛舍的環(huán)境衛(wèi)生，是防治奶牛乳房炎工作的重中之重。

3.2 中西藥的抑菌效果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，奶牛乳房炎的主要病原菌中絕大部分對(duì)青、鏈霉素和紅霉素耐藥，用傳統(tǒng)的青霉素、鏈霉素以及紅霉素療法效果已幾乎無效，但對(duì)恩諾沙星、阿米卡星和慶大霉素等敏感性較高，這可能與該場(chǎng)在治療奶牛乳房炎方面較少使用這些藥物，因而病原菌并沒有產(chǎn)生較大的耐藥性。同時(shí)，奶牛乳房炎的主要病原菌對(duì)中藥組方敏感程度較高。因此，在以后的奶牛乳房炎的治療中，不能單一使用某一種藥物，或者過長(zhǎng)時(shí)間使用某種藥物。建議采取純中藥制劑防治奶牛隱性乳房炎。

[1] 曹訪，唐修君，陳麗，等.奶牛乳房炎研究進(jìn)展[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2006，14（4）：13-15.

[2] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：19-66.

[3] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：77-78，261.

劉明春（1965-），男，大學(xué)本科學(xué)歷，獸醫(yī)專業(yè)碩士，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校高級(jí)講師，主要從事畜牧獸醫(yī)專業(yè)課程教學(xué)與技術(shù)推廣工作。