武漢市第一醫(yī)院呼吸科，湖北 武漢 430022

非小細(xì)胞肺癌中PAX6表達(dá)及其對腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲作用機(jī)制研究

熊安洲 陳菁 曹艷 胡小萍

武漢市第一醫(yī)院呼吸科，湖北 武漢 430022

背景與目的：轉(zhuǎn)錄因子PAX6主要表達(dá)于胚胎期，不同腫瘤中PAX6呈現(xiàn)高表達(dá)，通過不同的信號通路發(fā)揮腫瘤抑制或促進(jìn)作用。檢測PAX6在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中的表達(dá)，通過RNAi下調(diào)其表達(dá)，研究PAX6對腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖力以及cyclin E、p38表達(dá)水平的影響。方法：應(yīng)用蛋白印記檢測86例NSCLC腫瘤組織及癌旁配對組織以及2例細(xì)胞系中PAX6的表達(dá)情況。應(yīng)用PAX6特異性siRNA序列，轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549，MTT法、Transwell小室、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的對比。蛋白質(zhì)印記法(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染前后cyclin E及p38表達(dá)情況。結(jié)果：對比癌旁組織及正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，PAX6在NSCLC組織及A549細(xì)胞系中顯著高表達(dá)。選取高效siRNA序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后，PAX6表達(dá)的下調(diào)抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖及集落形成，G1期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞侵襲及遷移力均下降。PAX6基因敲低細(xì)胞cyclin E及p38活性受到抑制，表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：PAX6通過調(diào)控MAPK通路及cyclin E的表達(dá)加速腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，是潛在的NSCLC診療靶點(diǎn)。

非小細(xì)胞肺癌；PAX6；SiRNA；p38；Cyclin E

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)生物學(xué)行為不同，肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lungcancer，SCLC)，其中NSCLC的比率高達(dá)80%，且NSCLC的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。近來的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌是診斷率最高的腫瘤，同時(shí)也是致死率最高的惡性腫瘤之一。本研究擬探討NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，尋找早期診斷和治療的NSCLC特異性標(biāo)志物。

PAX6基因隸屬PAX基因家族，編碼成對盒轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)育和疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮作用。PAX6是胚胎形成期重要的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是干細(xì)胞因子，在胰腺癌、胃腸腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)［1-2］，這提示其在腫瘤形成中可能發(fā)揮作用。本研究旨在揭示PAX6在NSCLC中表達(dá)及對肺癌細(xì)胞系的侵襲、增殖及遷移力的影響，并初步探討其作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織樣本及細(xì)胞系

收集武漢市第一醫(yī)院2008年1月—2012年9月外科手術(shù)治療的NSCLC患者，隨訪3～5年，選取具有完整臨床、病理和隨訪資料的NSCLC石蠟標(biāo)本86例組成實(shí)驗(yàn)組，所有患者術(shù)前均未接受放、化療或靶向治療。配對癌旁組織作為對照組。其中男性39例、女性15例，年齡25～78歲，平均45.23歲?；颊吲R床資料見表1。人類肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為實(shí)驗(yàn)組，人支氣管上皮細(xì)胞16HBE作為對照組，肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)使用加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，16HBE細(xì)胞則使用加入10%胎牛血清的MEM-EBSS液體培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑及設(shè)備

PAX6特異性siRNA序列(5'-GAGTAGCG ACTCCAGAAGT-3')及無沉默作用的siRNA序列NS-siRNA(5'-TTCTCCGAAC GTGTCACGT-3')由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)所用抗體購自Abcam公司。MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；RNA提取TRIzol試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。qPCR儀(7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng))和普通PCR儀(2720熱循環(huán)儀)均購自ABI公司，凝膠成像分析系統(tǒng)(GelDoc-It TS Imaging System)購自UVP公司。A549及16HBE細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

表1 肺癌患者一般臨床資料Tab. 1 Patients and clinical characteristics

1.3 方法

1.3.1 siRNA轉(zhuǎn)染

A549細(xì)胞在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長至占培養(yǎng)皿90%時(shí)消化，離心，轉(zhuǎn)入24孔板。當(dāng)細(xì)胞生長到約50%～60%的融合面積時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為3組，空白對照組僅加入轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染PAX6特異性siRNA組和轉(zhuǎn)染NS-siRNA的陰性對照組。

1.3.2 RNA、DNA及蛋白質(zhì)提取

包括蠟塊包埋組織及細(xì)胞中核酸及蛋白的提取，提取試劑盒購自天根公司，依照試劑盒操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取過程中注意樣品的污染和降解，RNA提取全程在冰上操作，提取樣品于-80 ℃保存，DNA樣品于-20 ℃保存，通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度儀測定所提取核酸濃度和純度，蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR檢測

本實(shí)驗(yàn)采用比較Ct值的相對定量法，以GAPDH為管家基因，應(yīng)用2-ΔΔCt進(jìn)行分析。定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件(25 μL)：SYBR premix(2×)12.5 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.3.3 Western blot檢測蛋白的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染72 h后提取細(xì)胞總蛋白，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，上樣量為30 μg，SDS-PAGE凝膠90 V電泳3 h，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、抗體溫育、顯色等常規(guī)步驟。圖像灰度分析比較蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照。

1.3.4 細(xì)胞增殖能力檢查(MTT法)

轉(zhuǎn)染24 h后，將轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與對照組細(xì)胞接種于96孔板，每孔體積200 μL，細(xì)胞數(shù)2×103個細(xì)胞，每組細(xì)胞接種6孔，以培養(yǎng)液為空白對照，培養(yǎng)24 h，使用MTT試劑盒檢測細(xì)胞增殖，每孔加5 mg/mL MTT，培養(yǎng)4 h后棄去上清液加150 μL DMSO，震蕩10 min，采用用酶標(biāo)儀檢測吸光度(A)值，波長490 nm，DMSO為內(nèi)參對照，連續(xù)測4 d，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.5 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲力

Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲力，小室外為加15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μL，小室內(nèi)為200 μL含5×103個細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞懸液，RPMI-1640培養(yǎng)液中加2%胎牛血清，每組重復(fù)6個樣本。培養(yǎng)24 h，取出小室，擦去微孔膜上層細(xì)胞，染色，計(jì)數(shù)移至下層的細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 劃線法檢測細(xì)胞遷移力

24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)5×104個，至形成單層細(xì)胞，用直徑1 mm消毒不銹鋼探針在底部劃橫線，沖洗細(xì)胞碎片后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察0、24、48、72 h細(xì)胞運(yùn)動情況，記錄從遷移起點(diǎn)至遷移最遠(yuǎn)點(diǎn)細(xì)胞核間距，每個視野選10個觀測點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用方差分析，數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAX6在NSCLC腫瘤組織、細(xì)胞系中表達(dá)結(jié)果

PAX6基因與管家基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異，無引物二聚體或其他非特異性產(chǎn)物，根據(jù)2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算得出，PAX6基因在NSCLC腫瘤組織、癌旁配對組織及A549細(xì)胞系相對表達(dá)量分別為(2.927±0.923)、(0.513±0.172)和(1.024±0.264)，16HBE細(xì)胞系中未見表達(dá)(圖1)。對比癌旁正常組織，NSCLC腫瘤組織中PAX6表達(dá)水平顯著上升(P＜0.05)。

圖1 PAX6基因在癌組織、癌旁正常組織及細(xì)胞系中表達(dá)情況Fig. 1 PAX6 gene expression in tumor and paired adjacent tissue and A549 16HBE cell

2.2 RNA干擾對A549細(xì)胞PAX6表達(dá)水平影響

Western blot檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染PAX6特異性siRNA組，PAX6表達(dá)水平顯著低于NS-siRNA組和空白對照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 PAX6-siRNA特異性siRNA顯著下調(diào)A549細(xì)胞PAX6蛋白水平Fig. 2 PAX6 expression was suppressed by PAX6-siRNA in A549 cell

2.3 MAPK信號通路蛋白p38及其磷酸化水平

PAX6基因敲除細(xì)胞培養(yǎng)72 h，提取蛋白經(jīng)Western blot檢測p38蛋白及磷酸化水平，結(jié)果顯示，PAX6基因敲除的A549細(xì)胞，p38蛋白磷酸化水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 PAX6表達(dá)下調(diào)細(xì)胞p38蛋白表達(dá)及磷酸化水平Fig. 3 p38 expression and phosphorylation was inhibited when PAX6 expression was suppressed

2.4 細(xì)胞周期蛋白cyclin E表達(dá)水平檢測

Western blot檢測PAX6敲除腫瘤細(xì)胞cyclin E表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PAX6敲除的A549細(xì)胞，cyclin E蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 PAX6表達(dá)下調(diào)細(xì)胞cyclin E蛋白表達(dá)水平Fig. 4 Cyclin E expression was inhibited while PAX6 expression was suppressed

2.5 轉(zhuǎn)染對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移力的影響

轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞增殖明顯減緩，細(xì)胞換液時(shí)間由原來的3 d推遲到6 d左右，PAX6-siRNA組生長明顯較空白對照及NS-siRNA組滯后(圖5)。侵襲力對比，空白對照組和NS-siRNA組穿膜能力較強(qiáng)，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(51±6)和(49±5)次，轉(zhuǎn)染后穿膜細(xì)胞數(shù)減低為(21±3)，顯著降低(P＜0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PAX6-siRNA組培養(yǎng)24 h后，劃痕縮小趨勢不明顯，48 h略縮小，但并無融合趨勢，72 h后，劃痕縮小，空白對照組和NS-siRNA組培養(yǎng)24 h，劃痕開始縮小，48 h明顯縮小，72 h劃痕已有融合趨勢，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移力出現(xiàn)下降。劃痕寬度對比見表2。

圖5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長曲線圖Fig. 5 Knockdown of PAX6 suppressed lung cancer cell growth

表2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞不同時(shí)刻劃痕寬度Tab. 2 Scratch width of 3 groups cells after transfection at 0, 24, 48 and 72 h

3 討 論

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率居高不下的惡性腫瘤之一，其預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生率也較高［3］。隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步，肺癌也是確診率最高的腫瘤之一，但盡管如此，肺癌的治療效果仍不理想，基于此，新的腫瘤分子靶點(diǎn)成為當(dāng)前惡性腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究的新策略。

PAX6基因定位于人類染色體11p13，編碼成對盒基因6，產(chǎn)物蛋白包含保守的成對盒狀結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)域能結(jié)合DNA，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能。PAX6基因在神經(jīng)系統(tǒng)及眼的發(fā)育過程中表達(dá)［4-5］。近來發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、胰腺癌等腫瘤及乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)PAX6呈高表達(dá)。肺癌中，有研究者發(fā)現(xiàn)PAX8和PAX5分別在NSCLC和SCLC中呈現(xiàn)高表達(dá)［6］，但卻未見PAX6相關(guān)研究的報(bào)道。PAX6在不同腫瘤中通過作用于不同信號通路發(fā)揮截然不同的作用，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和胰腺癌中發(fā)揮癌基因的作用，但在前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中卻發(fā)揮腫瘤抑制作用［7-8］。

絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路具有調(diào)控細(xì)胞有絲分裂和G1/S轉(zhuǎn)換的功能，MAPK信號通路中的p38蛋白通過磷酸化激活，發(fā)揮細(xì)胞有絲分裂調(diào)控作用。細(xì)胞分裂過程中，細(xì)胞周期蛋白同樣發(fā)揮著重要的作用，這其中cyclin E的作用尤為關(guān)鍵。

本研究首先通過定量逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法檢測NSCLC腫瘤組織、癌旁正常組織及A549、16HBE細(xì)胞系中PAX6基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示NSCLC腫瘤組織和A549細(xì)胞系中PAX6基因表達(dá)上調(diào)，16HBE細(xì)胞系中未見表達(dá)。研究結(jié)果與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、胰腺癌中結(jié)果一致［1,4］。為進(jìn)一步研究PAX6對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，本研究應(yīng)用特異性的PAX6-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞系。RNAi是一種反向遺傳學(xué)技術(shù)，具有操作簡單、高效等特點(diǎn)，已逐漸成為基因功能研究的有效手段，本研究采用RNAi技術(shù)成功下調(diào)PAX6在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中的表達(dá)。

通過RNAi下調(diào)PAX6表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，增殖力、侵襲力和遷移能力均表現(xiàn)出明顯下降，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白cyclin E表達(dá)水平下調(diào)，MAPK信號通路p38蛋白的磷酸化水平出現(xiàn)明顯下降。Cyclin E及p38表達(dá)及磷酸化水平的改變導(dǎo)致了細(xì)胞增殖的滯后，有絲分裂停止在G1期。PAX6對細(xì)胞周期的影響與其他研究者在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中結(jié)果一致［9］。

腫瘤侵襲過程極為復(fù)雜，涉及基質(zhì)黏附、基質(zhì)成分蛋白水解以及腫瘤細(xì)胞遷移等步驟，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切，之前Mayes等［10］發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PAX6可通過抑制MMP2的表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的作用，PAX6的下調(diào)降低NSCLC腫瘤細(xì)胞侵襲力的具體機(jī)制有待進(jìn)一步的揭示，MMPs可能參與了此過程。

綜上所述，PAX6基因的高表達(dá)與NSCLC有著密切的關(guān)系，其作用機(jī)制涉及激活細(xì)胞周期蛋白及MAPK信號通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的無限增殖，PAX6基因可作為NSCLC發(fā)生、發(fā)展的潛在靶點(diǎn)，為NSCLC的診療提供新的方向。

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Expression and interaction mechanism of PAX6 in human non-small cell lung cancer

XIONG Anzhou, CHEN Jing, CAO Yan, HU Xiao-ping
(Department of Respiratory, First Hospital of Wuhan, Wuhan Hubei 430022, China)

CHEN Jing E-mail: 1803876732@qq.com

Background and purpose: The transcription factor PAX6 is primarily expressed in embryos. PAX6 is also expressed in several tumors and plays oncogenic or tumor suppressor role. This study aimed to investigate the expression of PAX 6 in non-small cell lung cancer (NSCLC) tumor samples and cell lines; and evaluate the effects of PAX6 on the proliferation and invasion of tumor cells and the expression level of cyclin E and p38. Methods: Western blot was carried out to detect the PAX6 protein level in 86 NSCLC tumor tissues, paired adjacent normal tissues and 2 cell lines. PAX6 siRNA was transfected into human lung cancer A549 cell line. Anchorage-independent growth and invasiveness of tumor cells were measured by MTT and transwell cell invasion assay, respectively. Cyclin E and p38 protein level before and after transfection were detected by western blot. Results: Comparison with tumor adjacent tissues and normal human bronchial epithelial cells 16HBE, PAX6 in NSCLC tissues and A549 cell lines was signi ficantly higher expression. After transfection with ef ficient sequence of PAX6 siRNA for A549 cell lines, the down expression of PAX6 inhibits tumor cell proliferation, the proportion of cells in G1phase increased, the cell invasion and migration decreased remarkably. Cyclin E and p38 activity was inhibited in PAX6 knockdown cells. Conclusion: PAX6 accelerate cell cycle progression by activating cyclin E and p38. PAX6 is a potential target for diagnosis and therapy.

Non-small cell lung cancer; PAX6; siRNA; p38; Cyclin E

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.08.008

R734.2

A

1007-3639(2014)08-0604-06

2014-02-05

2014-06-20）

武漢市衛(wèi)計(jì)委科研課題(No：WX14B03)。

陳菁 E-mail:1803876732@qq.com