河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011

RASSF10基因在賁門腺癌組織中的甲基化狀態(tài)及表達(dá)

崔建利 郭煒 郭艷麗 沈素朋 董稚明

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011

背景與目的：Ras相關(guān)域家族10基因(Ras-association domain family 10，RASSF10)在多種腫瘤組織中具有腫瘤抑制功能，然而在賁門腺癌組織中的研究尚未見報道。檢測賁門腺癌(gastric cardia adenocarcinoma，GCA)組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)情況，進(jìn)一步探討RASSF10基因在GCA發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法：分別應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)及免疫組織化學(xué)方法檢測81例GCA患者癌組織及癌旁正常組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：RASSF10基因在GCA組織中的啟動子區(qū)甲基化率(64.2%，52/81)顯著高于癌旁正常組織(21.0%，17/81，P＜0.05)，并與腫瘤組織的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均＜0.05)。RASSF10基因在GCA組織中的mRNA表達(dá)量(0.57±0.05)顯著低于癌旁正常組織(0.78±0.02，P＜0.05)，并與腫瘤組織的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均＜0.05)。RASSF10蛋白在GCA組織中的陽性表達(dá)率(31.1%，26/81)明顯低于癌旁正常組織(71.6%，58/81，P＜0.05)，并與腫瘤組織的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均＜0.05)。RASSF10基因在GCA組織中的甲基化率與其蛋白表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)。結(jié)論：RASSF10基因啟動子區(qū)的異常高甲基化導(dǎo)致的基因沉默可能是GCA發(fā)生的機(jī)制之一。

賁門腺癌；甲基化；RASSF10基因

賁門癌是發(fā)生于賁門黏膜上皮及腺體的癌，主要指原發(fā)于或占據(jù)于胃食管交接處以下2 cm內(nèi)的腫瘤，主要組織學(xué)類型是腺癌［1］。以往賁門癌常被列入食管癌或胃癌，近年隨著病理診斷技術(shù)及內(nèi)鏡篩查方法的不斷改進(jìn)而將其獨(dú)立出來，其發(fā)病部位與Barrett食管接近，其形態(tài)學(xué)、病因、治療和預(yù)防均不同于胃遠(yuǎn)端腺癌，臨床癥狀隱匿，絕大多數(shù)患者確診時已屬中晚期，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于其部位的特殊性，及表型、生長方式、組織學(xué)、細(xì)胞分化等方面具有多樣性的特征，近年來受到越來越多研究者的關(guān)注［2］。然而其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此，明確其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對于早期檢測及治療顯得尤為重要。Ras相關(guān)域家族(Ras-association domain family，RASSFs)共包含10個成員，RASSF1-RASSF10、RASSF1-6為經(jīng)典家族成員，RASSF7-10為N-端家族成員［3］。RASSF10基因?qū)儆贜-端家族成員之一，編碼N-端RA相關(guān)域，缺乏經(jīng)典家族成員特有的Sav-Ras-Hippo(SARAH)作用域。該基因?yàn)閱我煌怙@子基因，編碼507個氨基酸，定位于染色體11p15.2，位置上靠近RRAS2基因［4］。研究表明RASSFs成員在多種實(shí)體腫瘤組織中發(fā)生表觀遺傳失活。目前，有關(guān)RASSF10基因在(gastric cardia adenocarcinoma，GCA)組織中的研究還尚未報道。本研究檢測了組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)情況，旨在探討其在GCA發(fā)生、發(fā)展中的作用，以便探究GCA發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

蛋白酶K、甲基化酶SssⅠ購自Merck公司，DNA純化試劑盒、藍(lán)色體系、購自Promega公司。TRIzol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購自Fomentas公司，綠色體系購自Promega公司。所有引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。RASSF10兔抗人多克隆抗體、免疫組織化學(xué)SP試劑盒、DAB顯色劑購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司。

1.1.2 標(biāo)本

收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2011年9月—2012年9月間的GCA手術(shù)患者，共81例，其中男性50例，女性31例，年齡37～75歲，中位年齡58歲，所有患者術(shù)前均未給予任何放療與化療，標(biāo)本及其資料的收集均經(jīng)患者本人簽署知情同意書，且該研究經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)。標(biāo)本取自賁門腺癌原發(fā)灶及相應(yīng)癌旁正常組織(距離原發(fā)灶邊緣2 cm以上)。手術(shù)切除所采集的標(biāo)本，一部分用4%中性甲醛溶液固定，用于常規(guī)石蠟包埋，行免疫組織化學(xué)染色。另一部分用液氮保存，用于DNA和RNA提取，行甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)和RTPCR檢測。所有標(biāo)本均經(jīng)3位資深病理醫(yī)師通過HE染色確診。按腫瘤病理學(xué)分級，高分化25例(30.9%)，中分化10例(12.3%)，低分化46例(56.8%)。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：Ⅰ期10例(12.4%)，Ⅱ期56例(69.0%)，Ⅲ期10例(12.4%)，Ⅳ期5例(6.2%)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例。

1.2 方法

1.2.1 MSP方法檢測RASSF10基因CpG島的甲基化狀態(tài)

每個標(biāo)本均取10 μm石蠟切片約15片，經(jīng)蛋白酶K消化后，運(yùn)用酚/氯仿抽提法提取GCA組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的DNA，取2 μg DNA標(biāo)本進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換，依照DNA純化試劑盒步驟進(jìn)行純化。通過亞硫酸氫鹽處理后，單鏈DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)可脫去氨基轉(zhuǎn)為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶在甲基的保護(hù)作用下不能轉(zhuǎn)為尿嘧啶。運(yùn)用MethPrimer對RASSF10基因CpG島的分布情況進(jìn)行在線預(yù)測并結(jié)合亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的原理分別設(shè)計相應(yīng)引物(圖1)，以檢測RASSF10基因的甲基化狀態(tài)，引物、退火溫度見表1。反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)后，72 ℃終延伸7 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用UV凝膠電泳成像儀進(jìn)行圖像分析。陽性對照為甲基化酶SssⅠ處理基因組DNA進(jìn)行PCR，陰性對照為滅菌雙蒸水替代DNA模板進(jìn)行PCR。隨機(jī)選擇10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)以保證MSP的可靠性。

1.2.2 RT-PCR的方法檢測RASSF10 mRNA的表達(dá)

取凍存組織每例大約100 mg剪碎研磨，按TRIzol試劑說明提取RNA，并測定濃度及純度。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參照，引物、退火溫度見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)后，72 ℃終延伸7 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。利用Gel work-2ID軟件，對電泳圖像中RASSF10基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量研究。以RASSF10基因條帶的吸光度值和GAPDH條帶的吸光度值的比值表示RASSF10基因mRNA的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

圖1 RASSF10基因CpG島分布及MSP引物位置Fig. 1 CpG islands of RASSF10 gene and the location of primer for MSP

表1 RASSF10基因RT-PCR、MSP引物及反應(yīng)條件Tab. 1 Primer sequences and reaction conditions of RT-PCR and MSP for RASSF10 gene

1.2.3 免疫組織化學(xué)方法檢測RASSF10蛋白表達(dá)

組織經(jīng)脫水、包埋后每例常規(guī)3 μm連續(xù)切片，平貼于防脫載玻片上，置60 ℃烤箱中2 h備用。采用SP法，切片常規(guī)脫蠟，過氧化氫/甲醇溶液滴加于組織，室溫避光修復(fù)20 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，EDTA緩沖液高壓鍋抗原熱修復(fù)4 min。滴加一抗(稀釋比例為1∶100)，在4 ℃冰箱中過夜。次日依次滴加二抗和三抗試劑，顯微鏡下DAB顯色，蒸餾水終止顯色。蘇木素細(xì)胞核復(fù)染，逐級脫水，透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為空白對照，余步驟同上。正常胃黏膜組織為陽性對照。RASSF10蛋白以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐/棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，判定標(biāo)準(zhǔn)［5］：按照多數(shù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度列為4個等級：無顯色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。鏡下陽性細(xì)胞數(shù)所占比例≤25%為0分；26%～50%為1分；51%～75%為2分；＞75%為3分。將以上兩項(xiàng)得分相加：0分記為“-”，1～2分記為“+”，3～4分記為“++”，5～6分記為“+++”。其中“++”、“+++”為陽性表達(dá)，“-”、“+”為陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。MSP及免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床病理資料間的關(guān)系采用χ2和校正χ2檢驗(yàn)的統(tǒng)計方法，RT-PCR與臨床病理資料及MSP間的關(guān)系采用t檢驗(yàn)和近似t檢驗(yàn)，MSP與免疫組化間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性分析的統(tǒng)計方法。以上均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RASSF10基因在GCA中的甲基化狀態(tài)

全部81例GCA組織及癌旁正常組織均成功進(jìn)行了MSP檢測(圖2)。結(jié)果顯示，RASSF10基因啟動子區(qū)在GCA組織和癌旁正常組織中的甲基化率分別為64.2%(52/81)和21.0%(17/81)，GCA組織中RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P=0.010)。分組分析發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率(76.3%，29/38)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(53.5%，23/43，χ2=4.574，P=0.032)；Ⅲ、Ⅳ期組甲基化發(fā)生率(86.7%，13/15)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組(59.1%，39/66，χ2=4.044，P=0.044)；低分化組甲基化發(fā)生率(87.0%，40/46)明顯高于高、中分化組(34.3%，12/35，χ2=23.991，P=0.000)；年齡＜60歲組的甲基化發(fā)生率為65.3%(32/49)，≥60歲組的甲基化發(fā)生率為62.5%(20/32)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.066，P=0.797)；男性組的甲基化發(fā)生率為64.0%(32/50)，女性組的甲基化發(fā)生率為64.5%(20/31)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.002，P=0.962，表2)。

圖2 GCA中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)Fig. 2 Methylation analysis of RASSF10 gene in GCA tissues

表2 GCA組織中RASSF10基因的mRNA和蛋白表達(dá)、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料之間的關(guān)系Tab. 2 The relationship between mRNA, protein expression, methylation status of RASSF10 gene and GCA clinical pathological data

2.2 RASSF10基因mRNA在GCA組織中的表達(dá)

在81例GCA組織及相應(yīng)癌旁正常組織中檢測了RASSF10基因mRNA的表達(dá)(圖3)。GCA組織中RASSF10基因mRNA的相對表達(dá)量(0.57±0.05)顯著低于癌旁正常組織(0.78±0.02)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-36.940，P=0.000)。分組分析發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的RASSF10基因mRNA相對表達(dá)量(0.55±0.04)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.58±0.05，t=-2.512，P=0.014)；Ⅰ、Ⅱ期RASSF10 mRNA相對表達(dá)量(0.57±0.04)顯著高于Ⅲ、Ⅳ期RASSF10 mRNA相對表達(dá)量(0.53±0.05，t=4.086，P=0.000)；高、中分化組RASSF10 mRNA的相對表達(dá)量為0.58±0.06，低分化組RASSF10 mRNA相對表達(dá)量為0.56±0.04，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.711，P=0.092)；年齡＜60歲組的相對表達(dá)量為0.56±0.05，年齡≥60歲組的相對表達(dá)量為0.57±0.04，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.308，P=0.759)；男性組的相對表達(dá)量為0.56±0.04，女性組的相對表達(dá)量為0.57±0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.087，P =0.280，表2)。

圖3 GCA及癌旁正常組織中RASSF10基因的mRNA表達(dá)Fig. 3 mRNA expression of RASSF10 gene in GCA and corresponding normal tissues

2.3 RASSF10在GCA組織中的蛋白表達(dá)

81例GCA組織中有26例RASSF10蛋白表達(dá)呈陽性，其陽性率為32.1%；相應(yīng)癌旁正常賁門組織中58例RASSF10蛋白表達(dá)呈陽性，陽性率為71.6%，GCA組織RASSF10蛋白陽性率顯著低于癌旁正常組織(χ2=0.167，P=0.048，圖4)。RASSF10蛋白在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率(44.2%，19/43)顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率(18.4%，7/38，χ2=6.144，P=0.013)；Ⅰ、Ⅱ期RASSF10蛋白陽性率為37.9%(25/66)，顯著高于Ⅲ、Ⅳ期的6.7%(1/15，χ2=5.463，P=0.019)；高、中分化組RASSF10蛋白陽性率(71.4%，25/35)顯著高于低分化組(2.2%，1/46，χ2=43.739，P=0.000)；年齡＜60歲組的RASSF10的蛋白陽性率為30.6%(15/49)，≥60歲組的蛋白陽性率為34.4%(11/32)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.126，P=0.723)；男性組的RASSF10蛋白陽性率為28.0%(14/50)，女性組蛋白陽性率為38.7%(12/31)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.007，P=0.316，表2)。

2.4 RASSF10基因甲基化與表達(dá)之間的相關(guān)性

在RASSF10蛋白表達(dá)陽性的GCA組織中，其mRNA相對表達(dá)量為0.59±0.04，而在RASSF10蛋白表達(dá)陰性的GCA組織中，其mRNA相對表達(dá)量為0.55±0.04，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.266，P=0.000)。在RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化陽性的GCA組織中，其mRNA相對表達(dá)量為0.56±0.04，甲基化陰性的GCA組織中mRNA相對表達(dá)量為0.58±0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.507，P=0.014)。發(fā)生RASSF10基因啟動子區(qū)高甲基化的GCA組織中RASSF10蛋白陽性表達(dá)率為9.6%(5/52)，RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化陰性組的RASSF10蛋白表達(dá)陽性率為72.4%(21/29)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.686，P=0.000，表3)。RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化與其蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(P=0.000)。

圖4 賁門組織中RASSF10蛋白的表達(dá)Fig. 4 Protein expression of RASSF10 in gastric cardia tissue

表3 GCA組織中RASSF10基因甲基化與mRNA和蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Tab. 3 The relationship between methylation status and mRNA, protein expression of RASSF10 in GCA tissues

3 討 論

除多基因改變以外，表觀遺傳機(jī)制，尤其是DNA甲基化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，啟動子區(qū)CpG島的甲基化可改變癌癥相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)參與癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的信號通路［6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)Ras蛋白可以通過與RASSF家族效應(yīng)因子相互作用來調(diào)節(jié)多條信號通路影響細(xì)胞活動。據(jù)報道某些RASSFs成員(RASSF1A、RASSF2、RASSF4和RASSF5A)在多種類型的實(shí)體腫瘤中由于其啟動子區(qū)CpG島甲基化而發(fā)生表觀遺傳學(xué)失活［3,7］。

作為表觀遺傳學(xué)重要作用機(jī)制的DNA甲基化是惡性腫瘤發(fā)病的基本事件之一。腫瘤抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化引起的表達(dá)缺失，可導(dǎo)致其失去對腫瘤細(xì)胞生長的負(fù)性調(diào)控作用［8］。有研究報道RASSF10基因在白血?。?］、甲狀腺癌［10］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［11］、皮膚黑色素瘤［12］、前列腺癌［13］、胃癌［14］和食管鱗癌［15］中發(fā)生高度甲基化。然而，RASSF10基因在GCA中的甲基化狀態(tài)及表達(dá)尚未見報道。目前檢測DNA甲基化常見的方法主要有酶切法、直接測序法、MSP等，MSP與其他方法相比避免了使用限制性內(nèi)切酶，敏感性高，簡便易行，適用于大樣本檢測，但存在一定假陽性結(jié)果，適當(dāng)提高退火溫度可降低假陽性率，從而提高其特異度，為檢測DNA甲基化較為可信的方法。本研究通過MSP的方法發(fā)現(xiàn)RASSF10在賁門腺癌組織中的啟動子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這與文獻(xiàn)報道的RASSF10基因甲基化程度與轉(zhuǎn)移相關(guān)［10,12,15］這一結(jié)論相一致。本研究結(jié)果還顯示低分化組RASSF10基因甲基化率高于高、中分化組，Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，這提示GCA的分化程度及分期可能同樣與RASSF10基因的甲基化相關(guān)。研究隨后分別應(yīng)用RT-PCR及免疫組化的方法對RASSF10基因的mRNA及蛋白水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示GCA組織中該基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均顯著低于相應(yīng)癌旁正常組織，這與Schagdarsurengin等［10］報道RASSF10基因在乳腺組織以外的幾乎所有正常組織中高表達(dá)相一致。且經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，RASSF10基因啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化的GCA組織其mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于未發(fā)生甲基化組，提示RASSF10基因啟動子區(qū)的甲基化可能是導(dǎo)致該基因在GCA中失活的機(jī)制之一。此外Schagdarsurengin等［10］用去甲基化藥物5-aza-dC處理RASSF10基因表達(dá)缺失或降低的甲狀腺癌細(xì)胞系后，該基因的表達(dá)得以恢復(fù)或提高。Lu等［15］在多株食管癌細(xì)胞系中檢測到RASSF10基因mRNA表達(dá)水平的缺失或降低，并伴隨啟動子甲基化的發(fā)生，用去甲基化藥物5-aza-dC處理后，其表達(dá)得以恢復(fù)或提高。進(jìn)一步證明了RASSF10基因CpG島的甲基化可導(dǎo)致該基因在腫瘤中的沉默。Wei等［16］也通過去甲基化藥物5-aza-dC處理RASSF10基因mRNA的表達(dá)缺失的胃癌細(xì)胞系使得該基因的表達(dá)得以恢復(fù)。同樣提示啟動子甲基化可能是導(dǎo)致RASSF10失活的主要機(jī)制。此外Wei等［16］還證明RASSF10過表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長和集落形成，并在裸鼠體內(nèi)抑制腫瘤的形成，siRNA介導(dǎo)的RASSF10缺失可顯著促進(jìn)正常胃上皮細(xì)胞的生長，表明RASSF10具有腫瘤抑制功能。Hill等［11］在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的RASSF10可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系克隆形成力下降，同樣表明RASSF10具有腫瘤抑制功能。

Knudson的二次打擊學(xué)說指出表觀遺傳沉默和雜合性缺失是導(dǎo)致RASSF10雙等位基因失活的兩個相關(guān)機(jī)制［17］。有研究報道，RASSF10過表達(dá)可降低β-連環(huán)蛋白的核積累，增加TCF/ LEF轉(zhuǎn)錄活性［16］。并通過檢測β-連環(huán)蛋白下游基因(c-Myc、cyclinD1、cyclinE1)和過氧化物酶體增殖物激活受體(CF-1、TCF-4、CD44)的表達(dá)水平以探究RASSF10誘導(dǎo)生長抑制的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)這些分子的蛋白水平均顯著降低［18-21］。因此除DNA甲基化外，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑的抑制可能也是RASSF10誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制、促進(jìn)凋亡、降低細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

本研究證實(shí)GCA組織中RASSF10基因的甲基化率顯著高于癌旁正常組織，并伴隨轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的降低，且與腫瘤組織的分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此RASSF10有可能作為檢測GCA發(fā)生、發(fā)展及惡性程度的一個新的分子靶標(biāo)，以期其在臨床治療過程中發(fā)揮一定指導(dǎo)作用，然而其具體分子生物學(xué)機(jī)制有待深入研究。

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Methylation status and expression of RASSF10 gene in gastric cardia adenocarcinoma

CUI Jianli, GUO Wei, GUO Yan-li, SHEN Su-peng, DONG Zhi-ming
(Cancer Institute, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

DONG Zhi-ming E-mail: dongzhiming2000@aliyun.com

Background and purpose: RASSF10 acts as a kind of tumor suppressor in various tumor tissues, but researches in cardiac adenocarcinoma has not been reported. This study aimed to detect the methylation status and expression of Ras-association domain family 10 (RASSF10) in gastric cardia adenocarcinoma (GCA), and explore its role in occurrence and development of GCA. Methods: Methylation speci fic polymerase chain reaction (MSP), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry method were respectively used to detect methylation status, mRNA expression and protein expression of RASSF10 in 81 GCA tissues and corresponding normal tissues.Results: The promoter methylation frequency of RASSF10 in GCA tissues (64.20%, 52/81) was signi ficantly higher than that in corresponding normal tissues (20.99%, 17/81, P＜0.05), and was closely correlated with TNM stages, differential degree and lymph node metastasis (P＜0.05). RASSF10 mRNA expression in GCA tissues (0.57±0.05) was significantly lower than that in corresponding normal tissues (0.78±0.02, P＜0.05), and was closely correlated with TNM stages and lymph node metastasis (P＜0.05). Protein expression of RASSF10 in GCA tissues (31.10%, 26/81) was signi ficantly lower than that in corresponding normal tissues (71.60%, 58/81, P＜0.05), and was closely correlated with TNM stages, differential degree and lymph node metastasis (P＜0.05). The promoter methylation frequency of RASSF10 in GCA tissues was inversely related to its protein expression.Conclusion: Inactivation of RASSF10 caused by aberrantmethylation in the promoter region may be closely correlated with the GCA tumorgenesis.

Gastric cardia adenocarcinoma; Methylation; RASSF10 gene

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.08.002

R734.2

A

1007-3639(2014)08-0568-07

2014-05-27

2014-07-11）

國家自然科學(xué)基金(No：81101854)；河北省醫(yī)學(xué)研究重大專項(xiàng)基金(No：冀財預(yù)復(fù)[2012]2056號)。

董稚明 E-mail:dongzhiming2000@aliyun.com