魏暉　馬川蘭

摘要：納豆作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，在日常生活中扮演者十分重要的角色。其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的納豆激酶是一種溶栓性很好的物質(zhì)，其作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過溶栓酶等物質(zhì)在人體中發(fā)揮的作用，因此其生產(chǎn)越來越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)旨在通過納豆原料中油脂對(duì)產(chǎn)酶的影響，確定最大的產(chǎn)酶量，以此來提高產(chǎn)酶效率，達(dá)到在酶產(chǎn)量不變的情況下獲取油脂副產(chǎn)品，以便降低生產(chǎn)成本，便于工業(yè)產(chǎn)酶的大量生產(chǎn)。結(jié)果：在豆粕殘油量1%計(jì)算下，額外添加梯度油脂對(duì)枯草芽孢桿菌活菌產(chǎn)酶的影響不顯著。

關(guān)鍵詞：納豆 納豆激酶 油脂

中圖分類號(hào)：TQ920.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）08-0001-04

1 引言

納豆是日本的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，由黃豆經(jīng)過納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成[1]。生產(chǎn)工藝是將煮熟的大豆冷卻后接種納豆菌種，經(jīng)過恒溫發(fā)酵、4℃左右后熟等工藝制成，其成品有金黃的色澤，口感較為酥軟，挑起時(shí)呈現(xiàn)出較長(zhǎng)的拉絲現(xiàn)象[2]，當(dāng)用納豆與適宜作料配制后可制作成為可口的美食。納豆激酶（nattokinase，NK）是在納豆發(fā)酵過程中由納豆枯草桿菌產(chǎn)生。作為納豆生產(chǎn)中的主要含有物，其重要的溶纖維和溶栓[3]等作用已經(jīng)在臨床以及保健品劑中得到了廣泛的應(yīng)用，同時(shí)因其副作用小、溶栓徹底等特點(diǎn)已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)和養(yǎng)生學(xué)家的重視。

隨著糧食作物成本及勞動(dòng)成本的不斷提高，降低成本資金投入，增大原料利用率、提高產(chǎn)品的提取率已經(jīng)成為亟待解決的問題，因此，在成本不變甚至不斷增加的情況下，降低原料的投入，擴(kuò)大收益率，增加產(chǎn)率已經(jīng)成為必要途徑。本文研究了納豆生產(chǎn)中油脂對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響，通過此研究來確定油脂在納豆發(fā)酵過程中對(duì)枯草桿菌產(chǎn)酶的影響，以便達(dá)到生產(chǎn)酶制品的同時(shí)對(duì)大豆油脂進(jìn)行部分提取，以便降低成本，提高原料利用率達(dá)到生產(chǎn)原料的優(yōu)化配置和轉(zhuǎn)化，以實(shí)現(xiàn)企業(yè)效益的最大化。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 生產(chǎn)菌株

日本株式會(huì)社贈(zèng)送，菌株類型為枯草芽孢桿菌。

2.1.2 主要儀器（見表1）

2.1.3 主要試劑及配制方法

2.1.3.1 主要試劑

分析純?cè)噭喝纫宜?、磷酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、氯化鈉、鹽酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、液體溴、硫酸鋰、無水乙醇；生化試劑：干酪素、酪氨酸、酵母膏、蛋白胨、瓊脂。

2.1.3.2 主要試劑配制方法

（1）2%酪蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取干酪素5.000g，浸泡于50mL 0.1N NaOH溶液中放入冰箱中過夜，水浴中加熱煮沸使之溶解，再用pH7.5緩沖液定容至250mL的容量瓶中，放入冰箱貯藏。

（2）酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：取酪氨酸放入105℃干燥箱中烘干至恒重，精確稱取0.1g酪氨酸干粉，用少量0.2N鹽酸溶解并用蒸餾水定容至100mL，濃度為1000μg/mL。

（3）Folin-酚試劑：稱取鎢酸鈉（Na2Wo4·2H2O）10g、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）2.5g，加蒸餾水70mL于250mL的燒瓶中溶解。后加入85%的H3PO4 5mL，濃HCl 10mL，使用回流裝置，使其慢慢沸騰10個(gè)小時(shí)。停止加熱，冷卻后稱量硫酸鋰（Li2SO4·H2O）15g，水5mL，液體溴2-3滴，開口繼續(xù)煮沸15min，使溴水盡量揮發(fā)。待冷后用水稀釋至100mL，過濾后放入深色瓶中，保存于陰涼處（假如呈綠色，應(yīng)該繼續(xù)加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)蒸煮15min），顯色時(shí)加水2倍。

（4）0.4M三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸晶體6.536g用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，用棕色試劑瓶保存于避光干燥處。

（5）0.2M pH7.5磷酸鹽緩沖液：準(zhǔn)確稱取Na2HPO4 23.876g；NaH2PO45.196g溶解于500mL蒸餾水中保存。

（6）0.4M Na2CO3溶液：準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉4.2396g，溶解于100mL蒸餾水中保存。

（7）0.1N NaOH溶液：準(zhǔn)確稱取NaOH 0.4001g，溶解于100mL蒸餾水中。

（8）0.9% NaCl溶液：準(zhǔn)確稱取NaCl 0.9000g，溶解于100mL蒸餾水中保存。

2.1.4 培養(yǎng)基[4]

（1）LB固體培養(yǎng)基：NaCl 1.000g，瓊脂粉1.500g，酵母膏0.500g，蛋白胨1.000g，pH7.0-7.5；（2）LB液體培養(yǎng)基：NaCl 2.000g，蛋白胨2.000g，酵母膏1.000g，蒸餾水200mL，pH7.0-7.5。

2.2 方法

2.2.1 納豆生產(chǎn)的工藝流程

2.2.1.1 種子液制備

（1）配制：用電子天平稱取酵母膏1.000g；蛋白胨 2.000g；NaCl 2.000g；后用200mL蒸餾水溶解于500mL燒杯中；充分溶解，用玻璃棒攪拌均勻后，冷卻至常溫后用pH試紙測(cè)定pH值，后用1N的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在7.0-7.5之間，以達(dá)到發(fā)酵的要求；（2）分裝：種子液配好后，冷卻至常溫后用100mL量筒準(zhǔn)確量取50mL分裝入4個(gè)250mL三角瓶中；（3）滅菌：將配好的液體培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋中，設(shè)置溫度為121℃高壓蒸汽滅菌20min，滅菌結(jié)束后置于超凈工作臺(tái)中冷卻以待接種；（4）接種：取滅菌后的試管用移液器準(zhǔn)確量取10mL無菌水，用接種針無菌操作粘取保藏于試管斜面的菌體（1-2環(huán)），溶解于無菌水（10mL左右）中，后使用渦流混懸器充分混勻，結(jié)束后，用移液器（移液管）分別取2mL菌懸液加入到4個(gè)（培養(yǎng)液50mL）滅菌后的250mL三角瓶中，搖勻后用4層紗布包好；（5）培養(yǎng)：將4瓶接種好的液體培養(yǎng)基置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為37℃，恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為16h，作為種子液使用。

2.2.1.2 納豆發(fā)酵過程[5]

（1）浸泡：分別稱取20g豆粕，分裝入8個(gè)標(biāo)號(hào)（P1，P1+，P2+……P7+）的250mL三角瓶中，加入35mL或者60mL蒸餾水，根據(jù)浸濕情況適當(dāng)增加或者減少加入水量（每個(gè)三角瓶中加水量相同），保證用手指按壓時(shí)有濕潤(rùn)感但無水浸出，保證發(fā)酵過程的正常進(jìn)行。攪拌結(jié)束后置于常溫下放置16h左右，使豆粕充分吸水。 （2）蒸煮：取充分浸泡吸水的豆粕（攪拌觀察浸水情況，適當(dāng)添加，保持水分），用四層紗布和報(bào)紙包扎好后放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮，設(shè)定蒸煮溫度121℃，設(shè)定高壓蒸汽滅菌鍋蒸煮時(shí)間為30min，使豆粕充分成熟。（3）接種：用移液器吸取培養(yǎng)后的種子液2mL，加入到在超凈工作臺(tái)中冷卻（蒸煮后的豆粕冷卻溫度保證在40℃左右）的豆粕中。（4）油脂添加：接種結(jié)束后，按照梯度（0.00，1.00，1.50，2.00，2.50……4.00）加入大豆油脂，用玻璃棒攪拌均勻后用4層紗布包扎好。（5）發(fā)酵[2，3]：將接種后攪拌均勻的豆粕產(chǎn)品放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵處理，設(shè)定溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h。（6）后熟：發(fā)酵結(jié)束后，調(diào)節(jié)恒溫培養(yǎng)箱溫度，重新設(shè)定為4℃，開始進(jìn)行后熟處理，使豆粕充分成熟，保證豆粕原料的充分發(fā)酵，以達(dá)到風(fēng)味和感官的優(yōu)化。（7）水分含量測(cè)定：分別稱取干豆粕粉、后熟的產(chǎn)品準(zhǔn)確記錄其質(zhì)量，用紅外水分測(cè)定儀測(cè)定其水分含量。

2.2.2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取稀釋酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，后用蒸餾水進(jìn)行10倍稀釋，按照表進(jìn)行操作，后用移液器吸取稀釋后的溶液1mL，加入0.4M的碳酸鈉溶液，在40℃水浴中預(yù)熱5min后用移液器加入1mL Folin-酚試劑，置于40℃水浴鍋中顯色20min后測(cè)定吸光值，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 納豆激酶活力的測(cè)定[6，7]

2.2.3.1 粗酶液的提取

（1）浸泡：將后熟結(jié)束的發(fā)酵豆粕放入超凈工作臺(tái)中，無菌操作，從各個(gè)發(fā)酵的三角瓶中取出部分發(fā)酵豆粕，在電子天平上稱取4g左右，將豆粕加入到標(biāo)號(hào)的離心管中，后用移液管量取10.00mL的0.9%的生理鹽水（0.9% NaCl溶液），攪拌均勻后，放置2h，并不時(shí)的攪拌以最大限度的使酶液得到浸提，將離心管平放于試驗(yàn)臺(tái)。

（2）離心：浸提結(jié)束后，于離心機(jī)中進(jìn)行離心處理，設(shè)定溫度為15℃，轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)，離心10min以得到納豆發(fā)酵的產(chǎn)品納豆激酶的粗產(chǎn)品。

2.2.3.2 酶活力的測(cè)定[8]

（1）稀釋：用移液器吸取離心后的粗酶液1.00mL，用49.0mL 0.2M pH7.5的磷酸鹽緩沖液溶解稀釋； （2）樣品處理：①反應(yīng)（A樣品）：用試管分別取1.00mL稀釋后的酶液，放入40℃水浴鍋中預(yù)熱，同時(shí)40℃預(yù)熱2%酪蛋白溶液，準(zhǔn)確預(yù)熱5min后用移液器準(zhǔn)確量取1.00mL酪蛋白溶液加入1號(hào)試管，同時(shí)用秒表準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，迅速振蕩試管，使溶液混合均勻，保證納豆激酶與酪蛋白充分接觸，1min后加入第2管，按照上述方法依次重復(fù)第1管操作；10min后取出第1管，立即加入5mL 10%的三氯乙酸（AcCl3）溶液終止酶促反應(yīng)，振蕩均勻后繼續(xù)放入40℃水浴鍋中放置15min，11min后取出第2管，按照第1管操作加入5mL 10%的三氯乙酸（AcCl3）溶液，依次重復(fù)，全部結(jié)束后，再次40℃水浴放置15min；②對(duì)照（A對(duì)照）：用移液器準(zhǔn)確吸取1.00mL稀釋后的酶液加入試管中，置于40℃水浴鍋中預(yù)熱5min左右，先用移液管準(zhǔn)確加入5mL 10%的三氯乙酸溶液，并按照反應(yīng)組操作，用秒表準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，搖勻后繼續(xù)放入40℃水浴鍋中保持15min，并不斷震蕩，使酶充分失去活性，15min后用移液器加入1.00mL 40℃水浴鍋中預(yù)熱的酪蛋白溶液，振蕩均勻后，按照（i）中操作，用秒表計(jì)時(shí)后于水浴鍋中放置10min；③過濾：酶促反應(yīng)結(jié)束后分別把①，②中反應(yīng)液過濾，留取濾液待用；④顯色：分別取反應(yīng)濾液、對(duì)照濾液、蒸餾水各1.00mL加入到3支試管中，分別加入5mL 0.4M Na2CO3溶液，振蕩均勻后40℃水浴鍋中預(yù)熱5min，并用秒表準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，用移液器加入1.00mL Folin-酚試劑，并迅速振蕩均勻，1min后加入第2管，依次重復(fù)操作，反應(yīng)顯色20min結(jié)束后迅速將顯示液置于冷水中，以終止顯色，減小誤差；⑤OD值測(cè)定：顯色結(jié)束后，用添加蒸餾水顯色組作為對(duì)照進(jìn)行調(diào)零，分別測(cè)定對(duì)照液和反應(yīng)液的OD值以計(jì)算酶活力。

3 結(jié)果與討論

3.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

在680nm處測(cè)定一系列酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后的吸光度，以酪氨酸濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，從而得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Y=0.0101X+0.0055，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9970，酪氨酸濃度在0.01mg/L-1.00mg/L的范圍內(nèi)，其與顯色劑Folin-酚試劑顯色后的絡(luò)合物吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，因此可以根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果進(jìn)行有效分析。

3.2 油脂添加前后納豆激酶活力測(cè)定結(jié)果

在10%接種量下，添加油脂梯度，分析大豆油脂在納豆發(fā)酵過程中對(duì)枯草桿菌產(chǎn)酶的影響，其中油脂梯度如表所示，1號(hào)為為添加油脂的空白樣，其余為梯度添加對(duì)照。

利用0.9%的氯化鈉溶液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)品中納豆激酶的提取，得到粘度相對(duì)較大的納豆激酶粗酶液，經(jīng)過pH7.5的磷酸鹽緩沖液稀釋之后，反應(yīng)組進(jìn)行正常的酶促反應(yīng)，而對(duì)照組則先進(jìn)行酶的失活，并以此為對(duì)照，將反應(yīng)濾液用Folin-酚試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)酶促反應(yīng)后各個(gè)樣品的吸光值（見表2）與酪氨酸濃度在一定范圍內(nèi)良好的線性相關(guān)性來計(jì)算納豆激酶的活力（見表3）。

3.3 油脂單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

此試驗(yàn)為小樣本，同時(shí)有多個(gè)油脂添加梯度，需要進(jìn)行多重檢驗(yàn)，所以此分析可以采用F檢驗(yàn)的方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析結(jié)果見表4。從表中可以得出，8個(gè)梯度油脂添加產(chǎn)生的酶活力變化間差異不顯著，可以判斷油脂在納豆生產(chǎn)中對(duì)枯草桿菌產(chǎn)納豆激酶的作用不明顯，無明顯差異。

再以表2中數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，做出納豆激酶測(cè)定中吸光值隨油脂梯度變化曲線（見圖2）。

從圖中可看出，在顯色反應(yīng)中，吸光值隨油脂添加量的變化出現(xiàn)波動(dòng)，但是規(guī)律不是十分明顯。同時(shí)，在添加1.5mL（每20g）后，納豆激酶的活性有所提高，但隨著油脂濃度的增加，納豆激酶的活性沒有提高的趨勢(shì)，但根據(jù)多組平行試驗(yàn)的分析，以及方差分析結(jié)果得出，油脂在納豆生產(chǎn)中對(duì)納豆激酶的影響作用無顯著變化。同時(shí)，在測(cè)定中發(fā)酵的厚度、取樣范圍及均勻程度均受到一定的限制和影響，因此在測(cè)定中便可能會(huì)帶來很大的誤差和波動(dòng)。

4 結(jié)語

本論文利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行納豆產(chǎn)品的發(fā)酵，并且采用不常用的油脂提取后的豆粕作為主要的發(fā)酵原料，以此為基準(zhǔn)，通過外加大豆油脂來研究納豆生產(chǎn)中油脂對(duì)枯草桿菌產(chǎn)酶的影響，期望以此來判斷其影響，從而找到更加廉價(jià)的生產(chǎn)納豆激酶的工業(yè)方法，從而達(dá)到降低成本的目的，經(jīng)過單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出的初步結(jié)果如下：（1）影響納豆發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的因素很多，本論文通過從原料出發(fā)，利用豆粕作為發(fā)酵基料，經(jīng)過多組多批次的試驗(yàn)，分析得知，油脂在納豆發(fā)酵過程對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響無顯著變化。同時(shí)，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在一定油脂含量范圍內(nèi)納豆激酶的產(chǎn)量會(huì)有所提高，在油脂含量在8.64%（按豆粕油脂殘留1%計(jì)）左右有較大酶活力，多次試驗(yàn)證明，但隨著油脂的不斷添加，納豆激酶的出現(xiàn)不太規(guī)律的上下波動(dòng)，趨勢(shì)變化不明顯。（2）在納豆的取樣分析時(shí)，由于發(fā)酵納豆桿菌的好氧特性，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中只有上部表層有白色粘稠類似物出現(xiàn)，三角瓶底部顏色較深，且發(fā)酵跡象不明顯，所以可以看出在取樣時(shí)會(huì)出現(xiàn)較大的誤差，因此，在以后試驗(yàn)時(shí)要注意最優(yōu)厚度的確定，并且盡可能在發(fā)酵過程中進(jìn)行攪拌，達(dá)到發(fā)酵的均一化保證對(duì)所分析因素干擾的排除。

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