王鳳梅，蔣克國，張桂霞，周海勝，查曉軍，郝 麗，王德光

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是我國終末期腎臟病（ESRD）的主要原因之一，且比重逐年上升。眾多研究表明，長期血糖升高可激活多元醇通路、PKC通路、已糖胺途徑，促使活性氧類產(chǎn)生過多，以及葡萄糖在非酶促下生產(chǎn)的糖基化終末產(chǎn)物（AEGs）在細胞外聚集，導致細胞外基質(zhì)蓄積、腎小球硬化等病理改變。高糖還可誘導多種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等表達參與這一過程［1］。然而，DN的發(fā)生發(fā)展機制目前還不是十分清楚，是否有其他重要蛋白和信號轉(zhuǎn)導通路參與其發(fā)病進展過程有待于進一步研究。

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種具有多種功能的磷酸化糖蛋白，主要與avβ整合素或CD44家族結(jié)合，參與細胞間黏附、趨化、遷移和信號傳導等生理及病理過程，在腫瘤、動脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在糖尿病動物模型中發(fā)現(xiàn)腎臟OPN表達升高，利用基因敲除OPN基因后，可減輕系膜細胞膨脹，降低尿蛋白產(chǎn)生，并發(fā)現(xiàn)OPN通過激活NF-κB途徑，增加足細胞能動性，參與蛋白尿的形成［2］。在DN中，腎臟局部表現(xiàn)為炎性細胞浸潤、間質(zhì)纖維化，伴OPN、TGF-β等表達升高，利用抗體中和OPN表達后，減輕局部的巨噬細胞聚集，延緩纖維化進展［3］。以上研究表明，OPN參與DN單核巨噬細胞聚集、間質(zhì)纖維化及蛋白尿產(chǎn)生等過程，一定程度上抑制OPN表達后可減輕上述病變，但引起OPN表達升高的具體機制仍不清楚。探討OPN是否能成為逆轉(zhuǎn)DN病理改變新的靶點及其具體的調(diào)控機制，目前已成為研究熱點。

在本實驗中，我們以HK-2細胞為模型，研究高糖刺激下OPN的表達，并進一步探討其調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥品 DMEM低糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度4.5 mmol·L－1）、DMEM高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度25 mmol·L－1）購于美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；鼠抗p-AKT（ser473）、p-S6，兔抗 Raptor和 Rictor購自 Cell Signaling；兔抗OPN購自美國Abcam公司；鼠抗β-actin、辣根過氧化酶標記的IgG羊抗鼠和羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司。TRIzol試劑盒、DMSO試劑購自上海生工；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司；ECL顯影劑和PVDF膜購自美國Millipore公司。LY294002（溶于DMSO）購于碧云天生物研究所；rapamycin（溶于 DMSO）購于 Sigma公司；Lipo-fectamine 2000購于Invitrogen公司。

1．2 HK-2細胞培養(yǎng) HK-2細胞為東南大學附屬中大醫(yī)院劉必成教授惠贈，給予DMEM低糖培養(yǎng)基和10%胎牛血清，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，當細胞密度為80%～90%時，用0.25%胰酶（含0.1 mol·L－1EDTA）消化傳代。實驗組換用DMEM高糖培養(yǎng)基，對照組用含相同濃度甘露醇的DMEM培養(yǎng)基，檢測高糖刺激不同時間點（12、24、48、72 h）OPN的表達。

1．3 RNA干擾 高糖培養(yǎng)24 h的HK-2細胞接種在12孔板中，繼續(xù)高糖培養(yǎng)24 h，使細胞密度達40%～50%，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，參照 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染 Raptor、Rictor及隨機無靶點陰性對照（NC）siRNA。以上siRNA均由上海Gene Pharma公司合成，序列分別為 5′-GGACAACGGCCACCAGUAC-3′； 5′-ACUUGUGAAGAAUCGUAUC-3′；5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。siRNA轉(zhuǎn)染4～6 h后換用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h收樣，Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達。

1．4 Real-time PCR法檢測OPN mRNA表達 按TRIzol試劑說明書抽提不同組HK-2細胞總RNA。按標準步驟進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進行Real-time PCR實驗，以β-actin為對照。Real-time PCR引物由上海生工合成，引物如下：OPN上游5′-AGCACAGCATCGTCGGGAC-3′，下 游 5′-TCCTTGGTCGGCGTTTGGCTG-3′；β-actin上游 5′-CACCCGCCGCCAGCTCAC-3′，下 游 5′-GCCCCACGATGGAGGGGAAGA-3′。以比較Ct法的相對定量表達差異計算，2－△△Ct表示基因的相對表達量：△△Ct＝［Ct（待測基因）－Ct（β-actin）］試驗組 －［Ct（待測基因）－Ct（β-actin）］對照組。

1．5 Western blot檢測 OPN、p-AKT、p-S6、Raptor、Rictor蛋白表達 細胞按實驗分組條件處理后，收集細胞，加入蛋白提取液裂解細胞。紫外分光光度計測定蛋白含量，每樣本各取50μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印2 h，以5%脫脂奶粉封閉45 min，分別加入稀釋的一抗OPN（1∶1 000），p-AKT（1 ∶100），p-S6（1 ∶1 000），Raptor（1∶1 000），Rictor（1∶1 000），β-actin（1∶1 000）于4℃孵育24 h后，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗室溫孵育4 h，ECL化學發(fā)光法顯色，曝光顯影，掃描儀掃描結(jié)果。GEL-Pro4圖像分析軟件分析結(jié)果，表達強度用OPN／β-actin，再用對照組平均值為1進行校正。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.0軟件系統(tǒng)進行分析，計量資料用ˉx±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 高糖刺激上調(diào)HK-2細胞中OPN mRNA及蛋白的表達 為分析高糖對HK-2細胞OPN表達的影響，HK-2細胞經(jīng)低糖培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，換成高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，緊接著在不同時間點收集細胞，分析OPN的表達。如Fig 1 A所示：Real-time PCR分析表明，高糖刺激后OPN mRNA表達水平呈時間依賴性升高。高糖刺激48 h后，OPN mRNA的表達水平達高峰，是對照組的（1.60±0.03）倍（P＜0.05）。進一步Western blot分析也表明，高糖呈時間依賴性上調(diào)OPN蛋白的表達，以72 h最高，但與48 h比較差異無統(tǒng)計學意義（Fig 1 B）。

Fig 1 mRNA and protein expression of OPN in HK-2 cells cultured in 25 mmol·L－1 glucose

2．2 高糖激活 PI3K／AKT／mTOR信號通路PI3K／AKT／mTOR信號通路在代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［4］。為研究高糖刺激是否對 PI3K／AKT／mTOR信號通路有影響，我們提取高糖刺激48 h后的HK-2細胞蛋白裂解液，并通過Western blot分析p-AKT和p-S6（mTOR的下游靶分子及活性指標）的表達情況。研究表明，與對照組相比較，高糖刺激后p-AKT和p-S6蛋白的表達明顯上調(diào)。因此，高糖激活PI3K／AKT／mTOR信號通路（Fig 2）。

Fig 2 Effect of high glucose on protein expression of p-AKT and p-S6 in HK-2 cells induced by 25 mmol·L－1 glucose（HG）for 48 h

2．3 抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路下調(diào)高糖刺激下OPN的表達 為探討高糖刺激是否通過激活PI3K／AKT／mTOR信號通路上調(diào)OPN的表達，我們應用PI3K特異性抑制劑LY290042、mTOR特異性抑制劑rapamycin處理HK-2細胞，觀察高糖刺激下OPN的表達情況。研究結(jié)果表明，LY290042和rapamycin均明顯降低了OPN的表達水平，且兩者聯(lián)合使用發(fā)揮更好的效果（Fig 3）。因此，以上結(jié)果表明，高糖是通過激活PI3K／AKT／mTOR信號通路上調(diào)OPN的表達。

2．4 mTORC1介導了高糖刺激下OPN的表達mTOR在哺乳動物細胞中能與不同的蛋白結(jié)合組裝成兩種復合體，即 mTOR復合物1（mTORC1）和mTOR復合物2（mTORC2）。mTORC1對rapamycin敏感，它的特有組成成分為Raptor蛋白；而mTORC2對rapamycin不敏感，其特有組成成分為Rictor蛋白。為進一步確認mTORC1和mTORC2在高糖刺激下OPN表達增強中的作用，我們運用RNA干擾技術(shù)分別敲低了Raptor和Rictor，然后檢測高糖刺激下OPN表達變化的情況。如Fig 4所示，Raptor和Rictor siRNA均成功敲低了相應蛋白的表達；且與對照細胞相比，敲低 Raptor后 HK-2細胞OPN表達明顯減少（P＜0.05），而敲低Rictor后OPN表達無明顯變化。以上結(jié)果表明，高糖刺激是通過激活 PI3K／AKT／mTORC1信號通路上調(diào) OPN的表達。

Fig 3 Effects of LY294002，rapamycin and the combination on protein expression of OPN in HK-2 cells cultured in 25 mmol·L－1 glucose for 48h

3 討論

既往研究探討OPN在糖尿病動物模型及細胞實驗中的作用，如參與蛋白尿形成及炎細胞浸潤、氧化應激、膠原蛋白合成等過程［2－3，5－6］。本研究建立在OPN在DN中起作用的前提下，以HK-2細胞為實驗模型，發(fā)現(xiàn)，高糖刺激呈時間依賴性上調(diào)OPN mRNA及蛋白水平表達，同時高糖激活PI3K／AKT／mTOR信號通路。進一步探討高糖調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞OPN表達的機制，運用特異性抑制劑和RNA干擾技術(shù)，抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路，創(chuàng)新性提出高糖通過激活PI3K／AKT／mTORC1信號通路上調(diào)OPN的表達。

Fig 4 Protein expression of OPN in HK-2 cells transfected with siRaptor，siRictor

Lee等［7］在鼠腎小球上皮細胞中發(fā)現(xiàn)高糖通過激活PI3K／AKT通路，抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），活化mTOR，促進翻譯抑制分子eIF-4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）磷酸化，進而增加蛋白合成，促進腎臟肥大?；罨腜I3K／AKT／mTOR通路還參與DN中系膜基質(zhì)增生、EMT等病理改變，并損傷足細胞參與蛋白尿形成［8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，mTOR特異性抑制劑雷帕霉素（rapamycin）能夠延緩DN動物模型中GBM增厚及腎小球的肥大，減輕系膜基質(zhì)蓄積、減輕蛋白尿［9－11］。Junaid等［12］在人腎小管上皮細胞中發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K后可降低OPN mRNA表達，但未進一步探討下游具體信號通路。在DN大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素抑制OPN［13］，據(jù)此，我們推測雷帕霉素可能通過抑制PI3K／AKT／mTOR通路，下調(diào)腎小管上皮細胞OPN的表達來減輕DN的病理改變。本研究通過高糖刺激HK-2細胞，激活PI3K／AKT／mTOR信號通路，同時OPN表達升高，運用特異性抑制劑和RNA干擾技術(shù)從不同途徑抑制PI3K／AKT／mTORC1信號通路均降低OPN表達，而干擾mTORC2對OPN表達無影響，證實高糖通過激活PI3K／AKT／mTORC1信號通路上調(diào)OPN的表達。

實驗發(fā)現(xiàn)，高糖促進OPN在mRNA水平表達增加。OPN基因啟動子存在 NF-κB、Smads、TGF-β調(diào)控位點，DN中活化的 NF-κB、TGF-β／Smads通路可以在轉(zhuǎn)錄水平促進OPN的表達［14］。此外，高糖活化的PKC、腎小管處蓄積的AGEs，均可激活NF-κB和TGF-β／Smads信號通路，誘導相關(guān)基因如OPN、TGF-β活化［15］。且 OPN與 TGF-β存在相互作用，共同參與DN的發(fā)生、發(fā)展過程。在DN動物模型中，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以抑制 TGF-β／Smads通路及OPN表達，減輕腎小管－間質(zhì)損傷［13］。因此，活化的PI3K／AKT／mTORC1通路激活4E-BP1調(diào)控 NF-κB、細胞周期蛋白等蛋白質(zhì)的翻譯過程，NF-κB、TGF-β、avβ3是 PI3K／AKT／mTORC1通路的下游分子，我們猜測PI3K／AKT／mTORC1通路可能通過上調(diào)這些蛋白的活性來增強OPN的表達。我們在將來的研究中要進一步探討這個問題。Hsieh等在DN動物模型及高糖誘導下的鼠腎小管上皮細胞中，利用芯片分析發(fā)現(xiàn)氧化應激、PKC-β1信號通路及RAS系統(tǒng)均參與調(diào)控OPN，并且之間存在交互作用，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡［16－17］。因此，高糖調(diào)控OPN受多個信號通路調(diào)控，抑制 PI3K／AKT／mTORC1并不能完全阻斷OPN表達。

DN是糖尿病最嚴重并發(fā)癥之一，發(fā)生率高，危害性大，明確其發(fā)病機制，進而逆轉(zhuǎn)疾病進展成為研究熱點。本實驗揭示 PI3K／AKT／mTORC1／OPN在DN的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用，干擾、抑制這一通路可能是治療DN的一個新的靶點。我們已完成的研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1抑制劑雷帕霉素可延緩DN進展［5－6］，我們也將繼續(xù)在動物模型中探討該作用是否通過抑制OPN表達所致，進一步驗證OPN調(diào)控機制。

參考文獻：

［1］ Satirapoj B.Nephropathy in diabetes［J］.Adv Exp Med Biol，2012，771：107－22.

［2］ Lorenzen J，Shah R，Biser A，et al.The role of osteopontin in the development of albuminuria［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19（5）：884－90.

［3］ Kelly D J，Wilkinson-Berka J L，Ricardo SD，et al，Progression of tubulointerstitial injury by osteopontin induced macrophage recruitment in advanced diabetic nephropathy of transgenic（mRen-2）27 rats［J］.Nephrol Dial Transplant，2002，17（6）：985－91.

［4］ Zha X J，Sun Q，Zhang H B，et al.mTOR upregulation of glycolytic enzymes promotes tumor development［J］.Cell Cycle，2011，10（7）：1015－6.

［5］ Nicholas SB，Liu J，Kim J，et al.Critical role for osteopontin in diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，2010，77（7）：588－600.

［6］ Sun J，Xu Y，Deng H，et al.Involvement of osteopontin upregulation on mesangial cells growth and collagen synthesis induced by intermittent high glucose［J］.J Cell Biochem，2010，109（6）：1210－21.

［7］ Lee M J，F(xiàn)eliers D，Mariappan M M，et al.A role for AMP-activated protein kinase in diabetes-induced renal hypertrophy［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292（2）：F617－27.

［8］ Inoki K，Mori H，Wang JY，et al.mTORC1 activation in podocytes is a critical step in the development of diabetic nephropathy in mice［J］.J Clin Invest，2011，121（6）：2181－96.

［9］ 王德光，李學旺，李 航，等.胰島素通過激活PI3K／mTOR通路誘導人系膜細胞血管內(nèi)皮細胞生長因子轉(zhuǎn)錄 ［J］.中國糖尿病雜志，2009，17（4）：308－10.

［9］ Wang D G，Li X W，Li H，et，al.Insulin stimulates vascular endothelial growth factor gene expression in mesangial cells through a PI3K／mTOR signaling pathway［J］.Chin J Diabet，2009，17（4）：308－10.

［10］王德光，李學旺，李 航，等.小劑量雷帕霉素延緩小鼠糖尿病腎病進展的研究 ［J］.中國糖尿病雜志，2010，18（7）：500－3.

［10］Wang D G，Li X W，Li H，et，al.A low dose of rapamycin ameliorates renal injuries of type 2 diabetic mice［J］.Chin J Diabet，2010，18（7）：500－3.

［11］Lloberas N，Josep M C，Marcalla F，et al.Mammalian target of rapamycin pathway blockade slows progression of diabetic kidney disease in rats［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17（5）：1395－404.

［12］Junaid A，Amara F M.Osteopontin：correlation with interstitial fibrosis in human diabetic kidney and PI3-kinase-mediated enhancement of expression by glucose in human proximal tubular epithelial cells［J］.Histopathology，2004，44（2）：136－46.

［13］羅利彬，劉 彬，王慧慧，等.雷帕霉素對糖尿病腎病大鼠組織TGF-β及 OPN表達的影響 ［J］.黑龍江醫(yī)學科學，2012，35（5）：5－6.

［13］Luo L B，Liu B，Wang H H，et al.Effect of rapamycin on the expression of transforming growth factor and osteopontin in the diabetic nephropathy rats［J］.Heilongjiang Med Pharm，2012，35（5）：5－6.

［14］Aoyama I，Shimokata K，Niwa T.Oral adsorbent AST-120 ameliorates interstitial fibrosis and transforming growth factor-beta（1）expression in sporitaneously diabetic rats［J］.Am J Nephrol，2000，20（3）：232－41.

［15］Oyama Y，Akuzawa N，Nagai R，et al.PPARγligand inhibits osteopontin gene expression through interference with binding of nuclear factors to A／T-rich sequence in THP-1 cells［J］.Circ Res，2002，90（3）：348－55.

［16］Hsieh T J，Chen R，Zhang S L，et al.Upregulation of osteopontin gene expression in diabetic rat proximal tubular cells revealed by microarray profiling［J］.Kidney Int，2006，69（6）：1005－15.

［17］Biecker E，De Gottardi A，Neef M，et al.Long-term treatment of bile duct-ligated rats with rapamycin（sirolimus）significantly attenuates liver fibrosis：analysis of the underlying mechanisms［J］.J Pharmacol Exp Ther，2005，313（3）：952－61.