王 秀，張競(jìng)競(jìng)，張 配，孫小錦，劉 哲，張?chǎng)斡?，?浩

雷公藤甲素（triptolide，TPL）又稱雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯醇，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物中分離的一種環(huán)氧二帖類內(nèi)酯化合物，是治療類風(fēng)濕病雷公藤片和雷公藤多苷片等制劑的主要有效成分［1］。現(xiàn)代研究表明，雷公藤甲素不僅具有高效的抗炎、抗類風(fēng)濕作用，還具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)某些腫瘤細(xì)胞的殺傷毒性甚至高于紫杉醇和阿霉素［2－3］。但在鼻咽癌中的研究較少，本文擬將雷公藤甲素作用于鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株，觀察其抗鼻咽癌的作用，并探討作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 雷公藤甲素（天津美倫醫(yī)藥集團(tuán)）；CNE-2Z細(xì)胞株，蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系生化藥理實(shí)驗(yàn)中心提供；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；兔抗人GRP78、Akt、pAkt抗體、鼠抗人 β-actin抗體購自Santa Cruz公司；山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ROS熒光探針-DHE（威格拉斯生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制 雷公藤甲素用二甲基亞砜（DMSO）配成 5.5 mmol·L－1貯液，－20℃保存。臨用前以 RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成 62.5、125、250、500、1 000、2 000及 4 000 nmol·L－1。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) CNE-2Z細(xì)胞接種于含10%新生小牛血清、青霉素（1×105U·L－1）、鏈霉素（100 mg·L－1）和 NaHCO3（33.7 mg·L－1）的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2.3 MTT測(cè)定細(xì)胞的增殖活性 細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5×103個(gè)每孔。培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，加新鮮含10%血清培養(yǎng)液180μl，對(duì)照組加入含0.01%DMSO的培養(yǎng)液20μl；藥物處理組加入不同濃度的雷公藤甲素溶液各20μl，使終濃度分別為 6.25、12.5、25、50、100、200及 400 nmol·L－1，其中DMSO含量不超過0.01%；同時(shí)設(shè)立調(diào)零組（無細(xì)胞組），加入200μl培養(yǎng)液。培養(yǎng)12、24、48 h后加入20μl MTT（以 PBS配成5 g·L－1），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150μl DMSO，37℃孵育30 min，酶標(biāo)儀上振蕩10 min，檢測(cè)波長570 nm處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率／%＝（實(shí)驗(yàn)組A值－調(diào)零組A值）／（對(duì)照組A值－調(diào)零組A值）×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 PI單染法測(cè)定雷公藤甲素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，5×106個(gè)每孔，培養(yǎng)24 h后，加藥處理，使雷公藤甲素的終濃度為 25、50、100 nmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，顯微鏡下觀察各處理組細(xì)胞的變化并拍照，收集細(xì)胞，2 500 r·min－1，離心5 min，洗滌2次；預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為0.75乙醇固定，4℃過夜。測(cè)試前用PBS溶液洗滌2遍，加 PI緩沖液（5 mg PI、0.1 g NaC6H5、100μl Triton-100、100μl ddH2O）300μl每管，避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 Western blot測(cè)定雷公藤甲素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)GRP-78、Akt的表達(dá)及Akt磷酸化的影響 將指數(shù)生長的CNE-2Z細(xì)胞胰酶消化、懸浮、計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×108個(gè)·L－1，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml，貼壁培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加藥處理24 h后冰上提取細(xì)胞全蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；封閉2 h，加一抗，4℃ 孵育過夜；洗膜后加二抗，室溫孵育2 h；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.2.6 雷公藤甲素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響 ROS熒光探針－二氫乙啶（dihydroethidium，DHE），可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶。氧化乙啶可參入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞ROS含量的多少和變化。將貼壁生長的CNE-2Z細(xì)胞用胰酶消化、懸浮，以5×106個(gè)每孔接種于6孔培養(yǎng)板，貼壁生長24 h，棄培養(yǎng)液，給藥處理4 h，加入二氫乙啶使其終濃度為5μmol·L－1，37℃避光孵育 1 h，棄培養(yǎng)液，冰冷 PBS洗 3遍，胰酶消化，離心（800 r·min－1，5 min），收集細(xì)胞，用1 ml冰冷PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定，采用480～535 nm波長激發(fā)，590 nm～610 nm以上的發(fā)射，細(xì)胞可分成兩個(gè)亞群：ROS陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS陽性細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光。

2 結(jié)果

2．1 雷公藤甲素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的抑制作用 MTT結(jié)果顯示，雷公藤甲素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z具有較強(qiáng)的抑制作用，并且這種抑制作用隨著濃度的增加及作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，見Fig 1。25、50和100 nmol·L－1雷公藤甲素處理 CNE-2Z細(xì)胞48 h后，鏡下清晰可見隨著濃度的增加漂浮細(xì)胞增加，細(xì)胞密度降低，見Fig 2。

Fig 1 Triptolide inhibits proliferation of CNE-2Z cells

Fig 2 The morphological change of CNE-2Z cells after triptolide treatment

2．2 雷公藤甲素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z凋亡的影響 由 Fig 3可見，25、50和 100 nmol·L－1的雷公藤甲素作用CNE-2Z細(xì)胞24 h，均可引起CNE-2Z細(xì)胞的凋亡，其中100 nmol·L－1組的凋亡率達(dá)到了34.4%，占到整個(gè)抑制率46.2%的74%。

2．3 雷公藤甲素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)GRP78、Akt、p Akt的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素作用CNE-2Z細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)GRP-78蛋白的表達(dá)無明顯影響，但可明顯減少Akt的表達(dá)及其磷酸化水平，見Fig 4。

2．4 雷公藤甲素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 活性氧實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的雷公藤甲素均能誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z產(chǎn)生氧化應(yīng)激。由Fig 5可見，隨著雷公藤甲素濃度的升高，CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加。

Fig 3 Triptolide induces apoptosis of CNE-2Z cells

Fig 4 Effect of triptolide on expression of GRP-78，Akt and pAkt

Fig 5 Reactive oxygen species level elevated in CNE-2Z cells

3 討論

雷公藤甲素具有廣譜、高效的抗腫瘤作用，對(duì)急性白血病、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等都有較高活性［4－5］。研究表明，其高效的抗腫瘤作用主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)［6－7］，但其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚不清楚。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素對(duì)鼻咽癌也具有較強(qiáng)的抑制作用，同樣通過誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能與其誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，及抑制 Akt有關(guān)。

ROS由超氧離子、過氧化氫和羥自由基組成，是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)品。ROS水平對(duì)細(xì)胞生死有著重要的影響。生理情況下的ROS量小，作為信號(hào)傳導(dǎo)分子參與調(diào)解細(xì)胞的生理活動(dòng)［8］。輕度氧化應(yīng)激，ROS水平輕度升高，可促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、分化等適應(yīng)性變化；重度氧化應(yīng)激可使ROS劇烈增加，則造成細(xì)胞增殖阻滯、衰老、凋亡和壞死等損傷性變化［9］。腫瘤組織由于高代謝、低氧、缺血等，會(huì)持續(xù)誘發(fā)氧化應(yīng)激，使腫瘤組織內(nèi)ROS升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。但若腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)一步升高，則抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。腫瘤治療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡部分與生成內(nèi)源性氧化劑有關(guān)［10］。易靜等［11］研究表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，決定了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞凋亡率隨著雷公藤甲素濃度的增加而升高，說明細(xì)胞的凋亡與雷公藤甲素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生較高水平的ROS有關(guān)。

Akt是原癌基因c-Akt的表達(dá)產(chǎn)物，又稱蛋白激酶B，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生理代謝、衰老及疾病和癌癥等細(xì)胞生理病理活動(dòng)的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞面臨氧化損傷時(shí)，PI3K／Akt通路的活化對(duì)細(xì)胞存活非常重要。研究［12］發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)kt能保護(hù)細(xì)胞免受H2O2的損傷。反之，若Akt的活化受到抑制，細(xì)胞就失去了保護(hù)，在氧化應(yīng)激的刺激下，細(xì)胞發(fā)生損傷，進(jìn)而凋亡。實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤甲素可抑制Akt的表達(dá)及磷酸化，這一作用可能是雷公藤甲素誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z凋亡的主要原因。

總之，雷公藤甲素能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的生長，作用的機(jī)制可能與其誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及抑制Akt的表達(dá)及活化有關(guān)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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