陳 雯，費廣鶴

支氣管哮喘是一種由多種炎性細胞及氣道結(jié)構(gòu)細胞參與的慢性炎癥性疾?。?－2］。其最重要的病理生理特征是長期慢性缺氧和氣道及系統(tǒng)性慢性炎癥，并導(dǎo)致多臟器功能的損害［3］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是海馬，對慢性缺氧和炎性應(yīng)激非常敏感，是重要的受累部位。海馬作為邊緣系統(tǒng)的一部分，是下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)（HPA）軸的高位調(diào)節(jié)中樞，富含多不飽和脂肪酸，易受氧化應(yīng)激的損傷，是腦內(nèi)各種病理因子表達的敏感區(qū)［5－6］。哮喘等慢性應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮、損傷，引起海馬結(jié)構(gòu)和功能改變［7］。

褪黑素（melatonin，Mel）是松果體腺等分泌的吲哚類激素，具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等作用［8］。我們的前期研究［9－10］證實，哮喘患者的外周褪黑素水平下降，褪黑素在支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展中，可能呈現(xiàn)抗炎、抗氧化等保護性作用［11］。李光等［12］證實，褪黑素能抑制間歇低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，從而對間歇低氧導(dǎo)致的大鼠海馬損傷具有保護作用，但其分子生物學(xué)機制尚不明了。哺乳動物中，褪黑素多依賴褪黑素受體（melatonin receptor，MT）發(fā)揮作用［13］，其中，褪黑素受體 1（melatonin receptor 1，MT1）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛。因此，我們提出假設(shè)：機體為適應(yīng)哮喘的慢性炎癥及慢性應(yīng)激反應(yīng)，可能內(nèi)源性上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)褪黑素受體表達，彌補外周褪黑素水平的下降，參與神經(jīng)保護和神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過建立哮喘大鼠模型，用免疫組織化學(xué)、免疫印跡及RT-PCR等技術(shù)檢測哮喘組及對照組大鼠海馬組織MT1的分布及表達，結(jié)合血清中褪黑素水平的變化，初步探討海馬組織MT1在哮喘發(fā)生、發(fā)展中的神經(jīng)保護及神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑 山羊抗大鼠MT1抗體（美國，Santa Cruz公司），ABC免疫組織化學(xué)試劑盒（美國，Vector Laboratories公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（一步法）及PCR擴增試劑盒（大連寶生物公司），大鼠MT1和β-actin引物（生工生物工程上海有限公司），褪黑素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司）。

1.1.2 哮喘模型的建立及分組 成年SPF級♂SD大鼠60只，周齡7周，體質(zhì)量180～200 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成對照組（20只）和哮喘組（40只）。對照組隨機分為2組，每組10只，均于建模d 17取材，10只用于免疫印跡、RT-PCR及血清褪黑素檢測，10只用于免疫組織化學(xué)檢測。哮喘組隨機分4組，每組10只：分別于建模d 5、d 10、d 17取材以行免疫印跡、RT-PCR及血清褪黑素檢查的3組（d 5、d 10、d 17），及d 17取材行免疫組織化學(xué)檢測的一組。大鼠飼養(yǎng)在安靜、溫度（22±2）℃、12 h光照及12 h黑暗環(huán)境（L7∶00～19∶00，D19∶00～7∶00）。

哮喘模型的制備：①哮喘組：采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA，Sigma，GradeⅢ）致敏及激發(fā)建立哮喘模型；d1每只用OVA 500μg加氫氧化鋁干粉8 mg于生理鹽水1.5 ml配成混懸液，腹腔內(nèi)注射，于d 7予以10 g·L－1OVA 2 ml皮下注射增強致敏。d 14～17連續(xù)以8 L·min－1驅(qū)動流速超聲霧化器吸入10 g·L－1OVA 30 min，激發(fā)哮喘發(fā)作。哮喘大鼠表現(xiàn)為煩躁不安、呼吸急促、腹式呼吸、哮鳴音、腹肌收縮和跌倒。②陰性對照組：d 1和d 7分別予以生理鹽水替代OVA腹腔及皮下注射，d 14～17予以生理鹽水霧化吸入，每天30 min。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 分別在d 5、d 10、d 17 6∶00～6∶20 am收集眼眶靜脈血；全血離心后，血清標(biāo)本置－20℃冰箱保存待行褪黑素濃度檢測。后予以不同組大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，麻醉狀態(tài)下灌流生理鹽水，迅速取出海馬凍在干冰中，－70℃冰箱內(nèi)儲存，待行免疫印跡及RT-PCR檢查。擬行免疫組織化學(xué)檢測的大鼠在d 17 6∶00～7∶00 am予以戊巴比妥鈉麻醉后，打開胸腔，剪破右心耳，經(jīng)左心室行質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛（PBS，pH 7.4溶解）全身灌注固定，而后取海馬組織浸入質(zhì)量分數(shù)為30%的蔗糖／PBS過夜，常規(guī)包埋切片（厚度10 μm）待行免疫組織化學(xué)檢測。所有大鼠取材于當(dāng)日6∶00～7∶00 am完成。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測MT1在大鼠海馬組織的表達及定位 采用ABC法進行免疫組化學(xué)染色。切片常規(guī)脫蠟、水化，質(zhì)量分數(shù)為3%的雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)，質(zhì)量分數(shù)為 5%的羊血清（Vector Laboratories，USA）封閉，一抗羊抗鼠 MT1（1∶2 000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），37℃孵育1 h，4℃孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗IgG，室溫避光孵育30 min，滴加鏈霉親和素－過氧化物酶，室溫孵育1 h，DAB染色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒、染色強度高于背景非特異性染色者為陽性。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄 －聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測MT1 mRNA表達 取30 mg海馬組織，用柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，操作步驟按說明書進行。采用隨機引物方法擴增第1鏈cDNA。MT1聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物序列：上游引物5′-TGCCCTGGTGGTTTTCCATT-3′，下 游 引 物 5′-CAGTTTGGGTTTGCTGTCCG-3′；擴增片段大小121 bp。內(nèi)參β-actin上游引物5′-CACGGCATTGTCACCAACTG-3′，下游引物 5′-AACACAGCCTGGATGGCTAC-3′；擴增片段大小203 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃1 min，共36個循環(huán)，擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察結(jié)果，MUVB-20凝膠成像分析系統(tǒng)（Ultralum，USA）對擴增產(chǎn)物進行掃描，分別測定MT1及β-actin的吸光度值。

1.2.4 Western blot檢測MT1蛋白表達 取30 mg海馬組織在研磨器剪碎后，加入蛋白裂解液300μl，液氮內(nèi)研磨呈勻漿，冰上裂解30 min后，裂解液4℃下13 000×g離心5 min，取上清，并置于－20℃保存。BCA法（BCA protein assay kit；Pierce，Rockford，IL，USA）檢測蛋白含量，加 2×SDS加樣緩沖液，置于PCR儀上98℃變性10 min。按每孔25μg蛋白量加樣，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜后，用PBS緩沖液配制含質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉的封閉液4℃封閉過夜。分別加入一抗：MT1（1∶200，Santa Cruz）、β-actin（1∶500，Chemicon）和相應(yīng)二抗孵育，洗膜，ECL顯影，膠片成像。結(jié)果使用Kodak 1D image analysis DC290 software測定Western blot條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，進行半定量分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清褪黑素水平 Mel濃度采用ELISA法檢測，按說明書嚴格操作。吸50μl標(biāo)準(zhǔn)液、對照或樣品，加入酶標(biāo)試劑50μl溫育，洗滌；加入顯色劑A 50μl，封板膜封板后置37℃溫育30 min，洗滌，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min，加終止液50μl，終止反應(yīng)。以空白對照孔調(diào)零，在60 min內(nèi)在450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。此ELISA試劑盒檢測血清褪黑素水平的范圍為12.35～1 000 ng·L－1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示，使用SPSS 16.0軟件 （SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進行分析。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。

2 結(jié)果

2．1 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠海馬組織內(nèi)MT1分布 哮喘組與陰性對照組大鼠海馬組織中MT1表達均呈陽性，表現(xiàn)為聚集性棕黃色陽性顆粒，哮喘組MT1染色強度強于對照組。MT1廣泛分布于海馬組織中，CA1-CA3中MT1陽性的細胞主要集中于三角形胞體中。見Fig 1。

Fig 1 Immunohistochemistry of MT1 in hippocampus

2．2 RT-PCR檢測大鼠海馬組織內(nèi)MT1 mRNA水平表達 與陰性對照組比較，不同時期哮喘組大鼠海馬組織中MT1 mRNA表達均明顯增加（P＜0.05，n＝4）。與對照組比較，d 5哮喘組大鼠海馬組織中MT1mRNA表達明顯增加（P＜0.05，n＝4），但與d 10哮喘組無明顯差異（P＞0.05，n＝4）。d 17哮喘組大鼠海馬組織中MT1mRNA表達較陰性對照組及d 5組均明顯增加（P＜0.05，n＝4）；平均吸光強度與β-actin比較結(jié)果顯示，d 17哮喘組MT1分別是陰性對照組及 d 5的（3.75±0.14）倍及（2.14±0.06）倍。見 Fig 2。

2．3 Western blot檢測大鼠海馬組織內(nèi)MT1蛋白表達水平 與陰性對照組比較，不同時期哮喘組大鼠海馬組織中MT1蛋白表達均明顯增加（P＜0.05，n＝4）。與對照組比較，d 5哮喘組大鼠海馬組織中MT1蛋白表達明顯增加（P＜0．05，n＝4），但與 d 10哮喘組無明顯差異（P＞0.05，n＝4）。d 17哮喘組大鼠海馬組織中MT1蛋白表達較陰性對照組及d 5組均明顯增加（P＜0.05，n＝4）；平均吸光強度與βactin比較結(jié)果顯示，d 17哮喘組MT1分別是陰性對照組及d 5哮喘組的（3.20±0.16）倍及（1.50±0.05）倍。見 Fig 3。

Fig 2 Gene expression of MT1 in hippocampus

Fig 3 Protein expression of MT1 in hippocampus

2．4 血清Mel檢測 與陰性對照組比較，不同時期哮喘組大鼠血清Mel水平均明顯下降（P＜0.05，n＝10）。與對照組比較，d 5哮喘組大鼠血清Mel濃度明顯降低（P＜0.05，n＝10），但與d 10哮喘組無明顯差異（P＞0.05，n＝10）。而d 17哮喘組大鼠血清Mel濃度較對照組及d 5組均明顯下降（P＜0.05，n＝10）。見 Fig 4。

Fig 4 Serum melatonin levels in different groups

3 討論

本實驗以經(jīng)典的OVA方法成功復(fù)制哮喘大鼠模型，并通過免疫組織化學(xué)技術(shù)從形態(tài)學(xué)初步探討了MT1在大鼠哮喘海馬組織中的分布及表達，通過Western blot和RT-PCR技術(shù)證實了MT1在哮喘大鼠模型海馬組織中的過表達，且在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中，其上調(diào)趨勢呈時間依賴性；而同期血清褪黑素的水平則明顯下降。

褪黑素是一種受體依賴的吲哚類激素，其作為一種自由基清除劑，具有廣譜抗氧化能力［13］。由于高度的脂溶性，褪黑素可以自由通過血 －腦屏障［14］，并通過MT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)參與神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護作用。MT1及MT2在視交叉上核（SCN）、小腦、下丘腦、基底節(jié)、海馬等區(qū)域均有表達，尤其在海馬組織表達非常豐富［15］。本課題組先前的研究［9－10］證實，哮喘患者血清中褪黑素水平的下降，提示褪黑素可能參與哮喘的發(fā)病機制，但其與MT的關(guān)系及分子機制尚不明了。

近年來研究［16－17］表明，哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間存在著雙向的聯(lián)系及相關(guān)調(diào)節(jié)，如哮喘大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中SP、c-FOX蛋白等與肺內(nèi)呈現(xiàn)同樣的上升趨勢，哮喘的發(fā)病機制中可能存在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的參與?？紫橛⒌龋?8］指出，哮喘的慢性炎癥及慢性缺氧可引起海馬形態(tài)學(xué)的改變和炎性損傷。本實驗?zāi)M了哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程，從形態(tài)學(xué)、基因及蛋白水平證實了哮喘大鼠海馬組織MT1表達的進行性上調(diào)。海馬組織MT1的高表達彌補了外周褪黑素水平的下降，作為反饋性代償，在哮喘所致的慢性缺氧和應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮抗炎及抗氧化作用，參與清除自由基，并與HPA軸相互影響，可能參與神經(jīng)保護和神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)。本實驗中，海馬MT1表達的增高在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中呈現(xiàn)時間依賴性模式，即隨大鼠對變應(yīng)原（OVA）的接觸時間逐漸增加，而血清中褪黑素水平逐漸下降，外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)指標(biāo)變化的時間相關(guān)性表明兩者間可能相互影響，且與哮喘的發(fā)生、發(fā)展存在著某種因果聯(lián)系。在大鼠哮喘模型的建立過程中，海馬組織MT1在基因及蛋白水平表達上調(diào)的一致性，進一步證實MT1水平的增加源于哮喘大鼠內(nèi)源性的基因調(diào)控。上述實驗結(jié)果證實了我們預(yù)先的假設(shè)，即在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中，血清褪黑素水平逐漸下降，海馬MT1水平逐漸增加，表明MT1在哮喘大鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的神經(jīng)保護和神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，在哮喘的慢性炎癥及慢性應(yīng)激過程中，海馬MT1水平的內(nèi)源性上調(diào)，可能是機體應(yīng)對血清褪黑素外周水平降低的一種適應(yīng)性代償，增強了褪黑素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抗炎及抗氧化作用，從而參與哮喘的發(fā)病機制及神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)。其對褪黑素在哮喘的治療提供了新的途徑。

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