張妮，王世偉，茍興春，2

(1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，陜西西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，陜西西安 710021)

·綜述·

突觸囊泡內(nèi)吞的分子機(jī)制

張妮1，王世偉1，茍興春1，2

(1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，陜西西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，陜西西安 710021)

突觸傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其功能的最基本的方式。神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行著快速的突觸囊泡信息傳遞而沒有耗盡突觸囊泡，這主要依賴于突觸囊泡在神經(jīng)末梢進(jìn)行著精確而快速的內(nèi)吞作用。本文將主要介紹四種突觸囊泡的回收分子機(jī)制，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典途徑、Kiss-and-run、Bulk endocytosis以及2013年12月在Nature上報(bào)道的超速內(nèi)吞機(jī)制。

內(nèi)吞；網(wǎng)格蛋白；Kiss-and-run；Bulk endocytosis；超速內(nèi)吞

突觸是神經(jīng)元間信息傳遞的橋梁，包括突觸前膜、突觸后膜和突觸間隙。突觸傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)信息流通的最主要的方式。神經(jīng)信號(hào)的跨突觸傳遞是由突觸囊泡通過胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。突觸囊泡從內(nèi)吞體牙生后，神經(jīng)遞質(zhì)在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸囊泡中，充滿神經(jīng)遞質(zhì)的突觸囊泡運(yùn)送到突觸前膜的活動(dòng)區(qū)停泊，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳至突觸末端，鈣離子內(nèi)流觸發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，最終突觸囊泡通過內(nèi)吞作用重新回收進(jìn)入到下一個(gè)循環(huán)中。神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行著快速的囊泡傳遞而沒有耗盡突觸囊泡，這主要依賴于突觸囊泡在神經(jīng)末梢進(jìn)行著精確而快速內(nèi)吞作用。詳細(xì)的闡述突觸傳遞的內(nèi)吞機(jī)制對理解突觸傳遞的特異性、可塑性以及學(xué)習(xí)和記憶都至關(guān)重要。本文將主要介紹四種突觸囊泡的回收利用機(jī)制，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典途徑內(nèi)吞機(jī)制、Kiss-and-run、Bulk endocytosis以及2013年12月在nature上報(bào)道的超速內(nèi)吞機(jī)制(圖1)。

圖1 突觸囊泡內(nèi)吞循環(huán)機(jī)制

1 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典內(nèi)吞機(jī)制

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是突觸囊泡膜回收利用的經(jīng)典途徑。按其發(fā)生的過程可分為網(wǎng)格蛋白包被組裝、質(zhì)膜內(nèi)陷和凹窩形成、囊泡的剪切、去包被等過程。

1.1 網(wǎng)格蛋白包被組裝(Clathrin coats)突觸囊泡在活動(dòng)區(qū)(Active zone)完全融合釋放神經(jīng)遞質(zhì)后，囊泡膜成分快速向內(nèi)吞區(qū)移動(dòng)，典型的內(nèi)吞區(qū)和胞吐的活動(dòng)區(qū)間隔1 μm。囊泡膜成分一旦移動(dòng)到內(nèi)吞區(qū)，連接蛋白AP-2(Adaptors 2)就可將其識(shí)別，觸發(fā)網(wǎng)格蛋白和AP-180(Adaptors 180)、Stonin2、Epsin等其他連接蛋白協(xié)同形成網(wǎng)格蛋白包被[1-3]。網(wǎng)格蛋白包被由內(nèi)外兩層結(jié)構(gòu)構(gòu)成，外層的網(wǎng)格蛋白(Clathrin)和內(nèi)層的連接蛋白(Adaptors)。網(wǎng)格蛋白是一個(gè)三腳復(fù)合體，可以組裝成任何形狀和網(wǎng)格，從而形成包被的外殼和主要支架。連接蛋白通過含有SH3結(jié)構(gòu)域，BAR結(jié)構(gòu)域，ENTH/ANTH、PH結(jié)構(gòu)域等把網(wǎng)格蛋白包被與突觸前膜磷酸肌醇(PI)豐富的區(qū)域緊密連在一起。

1.2 質(zhì)膜內(nèi)陷和凹窩形成(Coated pit maturation)網(wǎng)格蛋白包被形成后，被包被的小段膜在曲率蛋白作用下逐漸彎曲、內(nèi)陷，形成凹窩。曲率蛋白包括所有參與網(wǎng)格蛋白包被的蛋白和其他含有α螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)吞蛋白、BAR結(jié)構(gòu)域的F-BAR分子，以及其他影響細(xì)胞骨架因素的蛋白[4-5]。曲率蛋白通過直接或間接與脂質(zhì)雙分子層中相連，或者影響細(xì)胞骨架的因素，最終導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層的不對稱性產(chǎn)生的而使質(zhì)膜內(nèi)陷，凹窩形成。體外實(shí)驗(yàn)和八目鰻的巨大神經(jīng)突觸進(jìn)行微注射的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，凹窩的形成不能由網(wǎng)格蛋白包被中的蛋白獨(dú)立完成，需要包括Endophilin、Epsin在內(nèi)的一些輔助因子參與[6-7]。突觸前若微注射抗Endophilin、Epsin抗體，然后刺激囊泡釋放，觀察到內(nèi)吞區(qū)出現(xiàn)大量微突起的包被凹窩堆積，囊泡的重新形成被抑制。其他的含有BAR-結(jié)構(gòu)域的分子，如SNX9/SNX18、FCHo、Toca也被證明參與了質(zhì)膜內(nèi)陷凹窩形成的過程[8-9]。

1.3 囊泡的剪切(Fisson)被網(wǎng)格蛋白包被的凹窩在曲率蛋白的作用下獲得足夠的彎曲度后，要產(chǎn)生一個(gè)新的囊泡，需要具有GTP酶作用的Dynamin蛋白的作用。囊泡的剪切是一個(gè)需能量過程，Dynamin引起的GTP水解驅(qū)動(dòng)剪切的進(jìn)行[10]。凹窩與突觸前膜連接的頸口處在Dynamin和Amphiphysin以及Endophilin等的作用下越變越窄。待凹窩縮縊進(jìn)行到一定程度，Dynamin在頸口通過多聚化形成環(huán)帶狀結(jié)構(gòu)，這種環(huán)帶狀結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生向內(nèi)擠壓的力量，在Amphiphysin和Endophilin等蛋白的幫助下，突觸前膜與囊泡膜相連的頸口最終斷裂，網(wǎng)格蛋白包被的囊泡從膜脫離。Dynamin是一個(gè)100 kD的GTP酶，Dynamin在囊泡剪切過程中的重要作用首次是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，破壞Dynamin表達(dá)后，盡管囊泡能與質(zhì)膜繼續(xù)融合，但是囊泡一直處在未成熟階段，突觸傳遞受到抑制。這一結(jié)果在小鼠的突觸研究中也得到證實(shí)，在缺乏Dynamin1，或者Dynamin1和Dynamin3同時(shí)缺乏的情況下，阻止了凹窩的剪切，導(dǎo)致凹窩在神經(jīng)元末端的聚集而阻礙了內(nèi)吞作用，并且Dynamin1的高表達(dá)與突觸前膜囊泡的產(chǎn)生分泌成正相關(guān)[11-12]。

1.4 囊泡去包被(Uncoating)囊泡被剪切后，迅速脫去網(wǎng)格蛋白包被，進(jìn)入下一個(gè)突觸囊泡循環(huán)。去除網(wǎng)格蛋白包被的過程是能量依賴性的，需要具有ATP酶活性的熱休克蛋白(Hsc70)和其輔酶Auxilin、4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)的水解酶等協(xié)同作用裂解多邊形的蛋白網(wǎng)格[13]。Hsc70本身表現(xiàn)出較低的ATP酶活性，它的酶活性能被一種輔助蛋白Auxilin激活。Auxilin是在神經(jīng)末梢含量豐富的胞質(zhì)蛋白，它幫助Hsc70與網(wǎng)格蛋白結(jié)合，從而?？康骄W(wǎng)格蛋白包被上。PIP2的水解酶主要參與去除包被中的連接蛋白。最近的研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠，蒼蠅和蠕蟲synaptojanin1基因，可在神經(jīng)末梢觀察到大量帶包被的游離囊泡的聚集，同時(shí)神經(jīng)末梢內(nèi)突觸囊泡的循環(huán)減弱；Synaptojanin1去磷酸化PIP2為磷酸肌醇4磷酸鹽(PI4P)，不僅去除網(wǎng)格蛋白包被的連接蛋白，而且能夠產(chǎn)生Auxilin的結(jié)合位點(diǎn)，表明Synaptojanin1在去包被的過程中起到重要作用[13-14]。同時(shí)，Auxilin通過其含有的張力蛋白樣結(jié)構(gòu)域催化Synaptojanin1來調(diào)控網(wǎng)格蛋白去包被作用[13]。因此，Hsc70、Auxilin和Synaptojanin三者協(xié)同參與去包被的過程。

2 Kiss-and-run

Kiss-and-run機(jī)制首先是在1994年研究蛙神經(jīng)肌肉節(jié)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)釋放后，囊泡膜未完全塌陷，僅形成納米級瞬時(shí)的融合孔道釋放神經(jīng)遞質(zhì)，隨后孔道關(guān)閉，突觸囊泡在活動(dòng)區(qū)回收利用，直接填充神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)入下一個(gè)突觸囊泡循環(huán)。這一機(jī)制與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典機(jī)制(20～30 s)中囊泡膜的完全塌陷不同，而且更迅速，整個(gè)過程大約只需要1 s，是突觸囊泡回收的補(bǔ)償途徑。但是，2003年Nature雜志報(bào)道了兩個(gè)研究小組的研究成果，他們用不同的熒光標(biāo)記，追蹤源自大鼠海馬的神經(jīng)元在接受單次電刺激后單個(gè)囊泡的變化，兩個(gè)小組均得出如下結(jié)論:大量的神經(jīng)遞質(zhì)釋放活動(dòng)涉及Kiss-and-run機(jī)制，而不是囊泡塌陷，表明Kiss-and-run機(jī)制并非只是突觸囊泡回收的補(bǔ)償機(jī)制[15-16]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元遞質(zhì)的釋放過程同時(shí)存在Kiss-and-run和囊泡膜完全融合兩種模式[17-19]。并且這兩種模式在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，高濃度的Ca2+、高濃度的Ca2+聯(lián)合Synaptotagmin-7可以逆轉(zhuǎn)突觸囊泡完全融合為Kiss-and-run中的不完全融合方式[20-21]。

Kiss-and-run的分子機(jī)制目前還不是很清楚，瞬間融合孔道的形成是SNARE復(fù)合體和細(xì)胞膜上其他因素相互作用的結(jié)果，這種相互作用未達(dá)到完全塌陷融合的閾值時(shí)形成瞬時(shí)融合孔[22-23]。最新的研究表明，肌動(dòng)蛋白Action和MyosinⅡ與SNARE復(fù)合體相互作用參與調(diào)控瞬間融合孔道的形成[24-25]。Dynamin1被證實(shí)在Kiss-and-run機(jī)制中起到重要作用，但不是起突觸囊泡剪切作用，而是在融合孔道處形成一個(gè)帽結(jié)構(gòu)，抑制囊泡膜其他部位與突觸前膜的繼續(xù)融合，而且能與Action協(xié)同關(guān)閉瞬時(shí)融合孔道[17-25]。

3 超速內(nèi)吞

2013年12月Nature上報(bào)道猶他大學(xué)和德國生物學(xué)家合作發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞循環(huán)利用囊泡的新機(jī)制——超速內(nèi)吞[26-27]。用一個(gè)單刺激來刺激培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞，然后迅速冰凍，用電子顯微鏡觀察其亞顯微結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)在刺激30 ms內(nèi)囊泡停泊并與質(zhì)膜融合，但并未發(fā)現(xiàn)完整的囊泡，而且觀察到囊泡融合有廣闊的開口，這表明超速內(nèi)吞機(jī)制中囊泡膜完全融合。突觸囊泡內(nèi)吞作用發(fā)生在刺激50～100 ms之間，活動(dòng)區(qū)和內(nèi)吞區(qū)之間，并且在電鏡下未看到明顯的網(wǎng)格蛋白包被的形成。因此超速內(nèi)吞是區(qū)別于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典途徑和Kiss-and-run機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)第三種內(nèi)吞作用機(jī)制。線蟲中研究中也同樣證實(shí)存在超快內(nèi)吞這一新的機(jī)制[28]。

超速內(nèi)吞作用受到肌動(dòng)蛋白聚合和Dynamin調(diào)控。在應(yīng)用肌動(dòng)蛋白的聚合劑和Dynamin的抑制劑后，電鏡照片顯示在突觸前膜上形成了巨大的融合囊泡，囊泡的剪切被抑制。

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典途徑中囊泡循環(huán)一次需要20 s，Kiss-and-run整個(gè)過程只需要1 s，而超速內(nèi)吞機(jī)制整個(gè)過程只需1/10 s，比經(jīng)典機(jī)制快200倍。超速內(nèi)吞的發(fā)現(xiàn)者認(rèn)為超速內(nèi)吞在突觸囊泡的回收中起到主要作用，沒有此機(jī)制，人類就無法實(shí)現(xiàn)連續(xù)的思考和行動(dòng)，而且這一過程可以保護(hù)神經(jīng)元，防止肌萎縮性側(cè)索硬化癥和阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病，幫助人類開發(fā)開發(fā)相應(yīng)的治療方式。

4 Bulk endocytosis

在中低強(qiáng)度刺激下，機(jī)體通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)經(jīng)典途徑、Kiss-and-run、超速內(nèi)吞機(jī)制回收突觸囊泡。在較強(qiáng)刺激下，主要依賴于Bulk endocytosis進(jìn)行突觸囊泡的回收循環(huán)。Bulk endocytosis途徑是一個(gè)可快速激活的大容量的內(nèi)吞途徑[29-30]。其主要過程為，在受到強(qiáng)刺激后，突觸前膜內(nèi)陷一大塊胞膜，形成一個(gè)大的“內(nèi)吞體”，在這個(gè)“內(nèi)吞體”上生成一批囊泡，而且補(bǔ)充胞內(nèi)內(nèi)吞體，形成內(nèi)吞體循環(huán)。Bulk endocytosis在哺乳動(dòng)物中成熟的的神經(jīng)突觸末端表現(xiàn)為快速激活并且在刺激過程中終止，整個(gè)過程小于1 s，表現(xiàn)為一種快速的內(nèi)吞過程；而在非哺乳動(dòng)物中Bulk endocytosis刺激停止后仍然能夠持續(xù)數(shù)分鐘，表現(xiàn)為一種慢速的內(nèi)吞過程。Bulk endocytosis途徑的的分子機(jī)制仍然不清楚，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)F-BAR超家族和肌動(dòng)蛋白參與了此機(jī)制。但這種機(jī)制不依賴于Dynamin1蛋白。即使在當(dāng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用嚴(yán)重受損，沒有Dynamin1的作用下也能夠發(fā)生。

5 展望

突觸傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其功能的最基本的方式。以往的研究表明，機(jī)體主要依靠網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典途徑回收利用突觸囊泡。而隨著研究的不斷深入，對這一理論提出了挑戰(zhàn)。Kiss-and-run、超速內(nèi)吞等高效快速內(nèi)吞過程在囊泡的內(nèi)吞作用中扮演了越來越重要的作用。但是，機(jī)體回收突觸囊泡主要依賴于經(jīng)典途徑還是高效的快速內(nèi)吞作用，亦或者兩者均在突觸囊泡的回收作用中起到重要作用，目前還不是很清楚，還需要進(jìn)一步的研究探討。

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Molecular mechanism of synaptic vesicle endocytosis.

ZHANG Ni1,WANG Shi-wei1,GOU Xing-chun1,2.The Department of Cell Biology&Translational,School of Basic Medical Sciences,Xi'an Medical University,Xi'an 710021, Shaanxi,CHINA;2.Lab of Cell Biology&Translational Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi, CHINA

Synaptic transmission is the most basic way for nervous system to realize its function.Neurons can sustain high rates of synaptic transmission without exhausting their supply of synaptic vesicles.This property relies on a highly efficient local endocytic recycling of synaptic vesicle membranes.This article summarizes four modes of synaptic vesicle endocytosis,which are clathrin-mediated endocytosis，kiss-and-run，bulk endocytosis and ultrafast endocytosis(reported in Nature in Dec.2013),with an emphasis on the underlying molecular mechanisms.

Endocytosis;Clathrin;Kiss-and-run;Bulk endocytosis;Ultrafast endocytosis

R329.2+6

A

1003—6350（2014）16—2404—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0937

2014-03-03)

陜西省科技廳科研經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(編號(hào)：2013JQ3017)；陜西省教育廳科研項(xiàng)目資助項(xiàng)目(編號(hào)：11JK 0665；2013JK0757)；西安醫(yī)學(xué)院?；?編號(hào)：10ZD01，12FZ23)；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃(編號(hào)：201211840013，201211840014)。

茍興春。E-mail：gouxingchun@189.cn