陳峰，李海龍，賴偉勇，譚銀豐

(1.海南省藥用植物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?571101)

LC-MS/MS法測(cè)定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅱ)

陳峰1，2，李海龍1，2，賴偉勇1，2，譚銀豐1，2

(1.海南省藥用植物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南海口 571101)

目的研究大鼠灌胃縮泉膠囊后，益智黃酮(楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚)二相結(jié)合產(chǎn)物的酶水解。方法雄性Sprague-Dawley大鼠膽管插管手術(shù)完畢后經(jīng)灌胃給予縮泉膠囊(1.64 g/kg)后收集0～4 h膽汁。膽汁樣品經(jīng)β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)處理后，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)進(jìn)行分析。結(jié)果益智黃酮的葡萄糖醛酸結(jié)合物在酶水解處理后，代謝物的色譜峰消失，釋放出黃酮的原形物質(zhì)形式。雖然脫甲基反應(yīng)后形成葡萄糖醛酸結(jié)合物也被水解，但并未能檢測(cè)到脫甲基產(chǎn)物。結(jié)論β-葡萄糖醛酸水解酶處理可進(jìn)一步確定益智黃酮在大鼠膽汁中的物質(zhì)形式，也為定量分析奠定基礎(chǔ)。

縮泉膠囊；益智；黃酮；酶水解；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

尿失禁主訴為尿液不自主的流出，是一種常見(jiàn)的、令人苦惱的疾病，給患者的生活質(zhì)量帶來(lái)不利影響[1]。尿失禁有多種致病因素，如膀胱功能障礙(過(guò)度活動(dòng)或活動(dòng)低下)、物理性的梗阻、感染或者藥物的副作用(如咖啡因)。某些較為嚴(yán)重的疾病如癌癥、糖尿病、中風(fēng)、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬皮病等也可引起尿失禁。根據(jù)全國(guó)六大區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果推斷，中國(guó)女性尿失禁患者平均發(fā)病率為30.9%，且年齡越大發(fā)病率越高。目前，人們對(duì)尿失禁的報(bào)道、診斷和治療顯著不足，對(duì)尿失禁的重視程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)，老年人口所占比例日趨增加，尿失禁問(wèn)題將對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)巨大困擾。

尿失禁的藥物治療越來(lái)越受到重視，化學(xué)藥物(如托特羅定、達(dá)非那新和奧昔布寧等)在整個(gè)藥物治療市場(chǎng)份額中占據(jù)主導(dǎo)地位，而縮泉丸及改進(jìn)制劑縮泉膠囊是為數(shù)不多的治療尿失禁的中藥品種。縮泉丸源于宋代的《魏氏家藏方》[2]，由益智仁、烏藥和山藥三味中藥組成，用于治療多尿、尿頻、遺尿，被2010版《中國(guó)藥典》一部收載[3]?？s泉丸在國(guó)內(nèi)9家企業(yè)生產(chǎn)(其中8個(gè)為水丸，1個(gè)為膠囊)，其中縮泉膠囊在2012年的銷售額達(dá)到5 000萬(wàn)元?？s泉丸多成分體內(nèi)過(guò)程研究較為薄弱，機(jī)體如何處置縮泉丸中的化學(xué)物質(zhì)尚待闡明。我們分析了縮泉丸中主要成分的含量[4]，并對(duì)大鼠灌胃縮泉丸后主要成分益智酮甲在大鼠系統(tǒng)中的暴露進(jìn)行了初步研究[5]。縮泉丸中黃酮類物質(zhì)的膽汁排泄研究有助于我們了解這些物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，作為這項(xiàng)研究的第一部分，本課題組已經(jīng)測(cè)定了大鼠膽汁中的二相結(jié)合產(chǎn)物，本文主要探討這些二相代謝產(chǎn)物的酶水解。

1 材料與方法

1.1 試藥β-葡萄糖醛酸水解酶(HP-2型，來(lái)自海曼蝸牛，每毫升含有100 000 U的β-葡萄糖醛酸水解酶和7 500 U的硫酸酯酶水解酶)購(gòu)自Sigma公司。其他同“LC-MS/MS法測(cè)定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)[6]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、給藥及樣品采集同“LC-MS/ MS法測(cè)定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)。

1.3 膽汁樣品的酶水解[7]取100 μl膽汁樣品，加入200 μl β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)，再加入50 μl抗壞血酸(5 mg/ml)，輕輕振搖后，在水浴上37°C孵育60 min。孵育結(jié)束后，加入1000 μl乙酸乙酯放在漩渦振蕩器上震蕩5 min，結(jié)束后將樣品至于離心機(jī)中，離心10 min，吸取上清液900 μl，在N2下吹干，加入50 μl甲醇，在漩渦振蕩器上震蕩5 min，再離心10 min，吸取40 μl樣品溶液置于樣品瓶的內(nèi)襯管中，進(jìn)樣量為10 μl。

1.4 LC-MS/MS分析方法色譜條件和質(zhì)譜條件同“LC-MS/MS法測(cè)定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)。

2 結(jié)果

2.1 白楊素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后白楊素及其可能的代謝產(chǎn)物見(jiàn)圖1。經(jīng)水解后，大鼠膽汁中處于結(jié)合狀態(tài)的白楊素被釋放出來(lái)(保留時(shí)間為5.94 min)，原來(lái)膽汁中的白楊素單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時(shí)間為4.14 min)和雙葡萄醛酸代謝物(保留時(shí)間為3.11 min)的色譜峰消失。

圖1 大鼠膽汁中白楊素二相代謝產(chǎn)物的水解

2.2 楊芽黃素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后楊芽黃素及其可能的代謝產(chǎn)物見(jiàn)圖2。膽汁中楊芽黃素的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時(shí)間為4.84 min)的色譜峰消失，釋放出楊芽黃素的原形產(chǎn)物(保留時(shí)間為7.06 min)。保留時(shí)間為5.23 min的色譜峰結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步的研究。

圖2 大鼠膽汁中楊芽黃素二相代謝產(chǎn)物的水解

2.3 伊砂黃素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后伊砂黃素及其可能的代謝產(chǎn)物見(jiàn)圖3和圖4。膽汁樣品經(jīng)甲醇沉淀后未出現(xiàn)伊砂黃素原形物質(zhì)形式，但酶水解后伊砂黃素從結(jié)合物中被釋放出來(lái)(保留時(shí)間為7.30 min)。保留時(shí)間為4.28 min的伊砂黃素單葡萄糖醛酸化代謝物以及保留時(shí)間為3.79 min雙葡萄醛酸代謝物的色譜峰消失，但5.29 min的色譜峰在酶水解時(shí)未完全消失。由圖4可知，保留時(shí)間為4.62 min和4.84 min的單葡萄糖醛酸結(jié)合物以及保留時(shí)間為3.16 min雙葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物的色譜峰在酶水解處理后均消失，但并未檢測(cè)到伊砂黃素的脫甲基化產(chǎn)物。

圖3 大鼠膽汁中伊砂黃素二相代謝產(chǎn)物的水解

圖4 大鼠膽汁中伊砂黃素脫甲基后的二相代謝產(chǎn)物的水解

2.4 芹菜素-4'，7-二甲氧醚二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后芹菜素-4'，7-二甲氧醚及其可能的代謝產(chǎn)物見(jiàn)圖5。經(jīng)酶水解后，膽汁中的硫酸酯化的代謝物(保留時(shí)間為3.29 min)和芹菜素-4'，7-二甲氧醚的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時(shí)間為5.11 min)均消失，此時(shí)的膽汁樣品可以檢測(cè)到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的原形物質(zhì)形式(保留時(shí)間為7.22 min)。由圖6可知，在膽汁樣品中未發(fā)現(xiàn)芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脫甲基化產(chǎn)物，芹菜素-4'，7-二甲氧醚脫甲基后所形成的二相結(jié)合產(chǎn)物，包括單葡萄糖醛酸結(jié)合物(保留時(shí)間為4.28 min)和雙葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物(保留時(shí)間為3.25 min和3.79 min)在酶水解處理后均消失。保留時(shí)間為5.29 min單葡萄糖醛酸結(jié)合物在該樣品中依然可以檢測(cè)到。但是，水解后的樣品中未檢測(cè)到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脫甲基化產(chǎn)物。

圖6 大鼠膽汁中芹菜素-4’,7-二甲氧醚脫甲基后二相代謝產(chǎn)物的水解

2.5 山奈素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后山奈素及其可能的代謝產(chǎn)物見(jiàn)圖7。膽汁樣品經(jīng)酶水解處理后，山奈素的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時(shí)間為4.80 min)和雙葡萄醛酸代謝物(保留時(shí)間為3.16 min)的色譜峰均消失，在膽汁中發(fā)現(xiàn)山奈素的原形物質(zhì)形式(保留時(shí)間為6.15 min)，但濃度較低。保留時(shí)間為6.05 min的色譜峰結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步的研究。

圖7 大鼠膽汁中山奈素二相代謝產(chǎn)物的水解

3 討論

二相代謝產(chǎn)物(如葡萄糖醛酸結(jié)合物、硫酸酯結(jié)合物等)的水解可采用酸水解或酶水解的方法進(jìn)行。酸水解時(shí)，將樣品和酸溶液在一定的溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，導(dǎo)致酯鍵斷裂。酸水解受酸的種類、濃度、水解溫度和水解時(shí)間的影響。酶水解相對(duì)比較溫和，但比較高效，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用也比較高。酶的來(lái)源、酶濃度、水解溫度和時(shí)間的也影響水解效果[8]?？偟膩?lái)說(shuō)，藥物二相代謝產(chǎn)物的水解首選酶水解的方法。因此本文采用酶水解的方法，研究益智黃酮二相代謝產(chǎn)物的水解。

白楊素、楊芽黃素、伊砂黃素、芹菜素-4'，7-二甲氧醚和山奈素的葡萄糖醛酸結(jié)合物在酶水解后釋放出相應(yīng)的苷元。因?yàn)橐辽包S素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚去單甲基后的單葡萄糖醛酸結(jié)合物有不同的結(jié)合位置，各有兩個(gè)色譜峰，水解后其中一個(gè)(保留時(shí)間為4.28 min)消失，另一色譜峰(保留時(shí)間為5.29 min)依然可測(cè)。另外，伊砂黃素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚脫甲基后形成的二相代謝產(chǎn)物在酶處理后也消失，但相應(yīng)的脫甲基后的黃酮苷元卻檢測(cè)不到。這些現(xiàn)象值得深入研究。

綜上所述，我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)膽汁中益智黃酮葡萄糖醛酸結(jié)合物被β-葡萄糖醛酸水解酶水解，釋放出相應(yīng)的苷元，進(jìn)一步確定了益智黃酮在大鼠膽汁中的物質(zhì)形式，也為這些黃酮苷元的定量分析奠定基礎(chǔ)。

[1]Robinson D,Cardozo L.New drug treatments for urinary incontinence[J].Maturitas,2010,65(4):340-347.

[2]孫世發(fā).縮泉丸方來(lái)源淺析[J].中醫(yī)雜志,1994,35(7):439.

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Identification of known chemicals and their metabolites in rat plasma after oral administration of SuoQuan capsules using LC-MS/MS(Ⅱ).

CHEN Feng1,2,LI Hai-long1,2,LAI Wei-yong1,2,TAN Yin-feng1,2.1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study enzymatic hydrolysis of the flavonoids'(tectochrysin,izalpinin,chrysin, kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)metabolites in rat bile after oral administration of SuoQuan capsules.MethodsCannulas were surgically inserted into the bile duct of male Sprague-Dawley rats(n=3)under anesthesia(pentobarbital,50 mg/kg,i.p.),and the bile was collected for 4 h after oral administration of Suoquan capsules(1.64 g/kg,suspended in 0.5%w/v sodium carboxymethycellulose).After β-glucuronidase(1000 units/ml in pH 5 acetate buffer)treatment,these phaseⅡmetabolites in rat bile samples were hydrolyzed and their aglycones were analyzed using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)with selected reaction monitoring mode.ResultsAfter β-glucuronidase treatment,the mono-or di-glucuronide metabolites of Yizhi flavonoids(tectochrysin,izalpinin,chrysin,kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)could not be detected.On the contrast, the corresponding aglycones were librated from their conjugated forms.However,the O-demethylation metabolites of izalpinin and apigenin-4',7-dimethylether could not be measured,although their glucuronidated conjugates had been found in the rat bile samples.ConclusionThe enzymatic hydrolysis via β-glucuronidase is helpful for the identification of Yizhi flavonoids'phaseⅡmetabolites.Meanwhile,this paper also lays a partial foundation for quantitative analysis of these aglycones.

Suoquan capsules;Alpinia oxyphylla(Yizhi);Flavonoids;Enzymatic hydrolysis;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）16—2347—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0918

2014-03-27)

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：812189，813188)

譚銀豐。E-mail：112552819@qq.com