郝洪軍 洪宇 謝琰臣 李海峰

不同儲存條件和反復凍融對血清和血漿乙酰膽堿受體抗體水平的影響

郝洪軍 洪宇 謝琰臣 李海峰

目的 探討不同儲存條件和反復凍融對血清和血漿乙酰膽堿受體抗體（ACh RAb）水平的影響。方法 將1例重癥肌無力患者的血清和血漿標本分成數(shù)等份，置于不同儲存條件下（常溫、4℃或—80℃）并經(jīng)過不同次數(shù)的凍融，不同等分的樣本使用同一批次商品化ELISA試劑盒雙平行孔檢測AChRAb水平。計算各種條件下血清和血漿標本ACh RAb抑制率的變異系數(shù)（），比較不同處理條件下的抑制率以及同一條件下血清和血漿標本的抑制率。結果 除常溫條件下血漿標本＞10%外，其余條件下均＜10%。4℃條件下血清AChRAb的抑制率顯著高于其他條件下血清的抑制率（＜0.05），4℃和常溫條件下血漿的抑制率顯著低于其他條件下血漿標本的抑制率（＜0.05）。4℃條件下血清和血漿標本ACh RAb抑制率差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），而冷凍保存后經(jīng)過多達5次凍融兩者的抑制率差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。結論 —80℃直接儲存的血清和血漿標本，即使經(jīng)過多次凍融，ACh RAb水平檢測結果仍可較為一致。血清標本在常溫、4℃或冷凍保存，血漿標本低溫冷凍保存，數(shù)日內完成檢測結果具有一致性。

重癥肌無力；乙酰膽堿受體抗體；儲存條件；凍融

乙酰膽堿受體抗體（anti-acetylcholine receptor antibody，ACh RAb）是重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）的主要的生物標志物，AChRAb檢測在MG的診斷和療效評價具有重要價值［1］。傳統(tǒng)的ACh RAb檢測方法是放射免疫沉淀法，ELISA法因其無放射性和容易開展而應用日漸廣泛，目前已有商品化的ELISA試劑盒應用于臨床。目前，國內只有少數(shù) MG診治中心能夠檢測ACh RAb，待測標本經(jīng)常需要在常溫或4℃環(huán)境運送至MG診療中心；研究所用標本通常于—80℃環(huán)境凍存后進行批量檢測，標本可能會經(jīng)過重復檢測及反復凍融。而且，有時只有血漿標本可供檢測，然而該ELISA試劑盒要求使用血清標本。目前尚缺乏血清/血漿中ACh RAb水平在不同溫度環(huán)境下穩(wěn)定性的研究，凍融對ACh RAb水平的影響亦未曾充分評估，血清和血漿標本采用ELISA法檢測的結果是否存在差異也無相關研究。基于以上問題，本文作者將1例MG患者的血清和血漿標本分成數(shù)等份，同時分別置于不同儲存條件下并經(jīng)過不同次數(shù)凍融，對該ELISA試劑盒檢測的ACh RAb水平進行比較。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 標本采集自1例25歲男性Ⅱb型MG患者，其MG病史3個月，無其他疾病病史。該患者的肌無力癥狀從眼外肌開始逐漸累及面部和肢體肌肉，標本采集時的QMG評分為10分。篩查未發(fā)現(xiàn)合并感染及其他自身免疫病。胸部CT檢測發(fā)現(xiàn)胸腺瘤，標本采集前已行胸腺切除，病理示B2型胸腺瘤。標本采集前未行免疫治療?；颊咭阎橥?。

1.2 方法 患者于上午10點左右在神經(jīng)科門診采集血液標本（不要求空腹）10 m L，采集試管為標準真空血清試管和標準真空EDTA抗凝試管，于室溫（20℃）于1800 r/min離心（離心半徑13.5 cm）8 min后留取血清，于3000 r/min離心（離心半徑13.5 cm）8 min后留取血漿。所有步驟均于半無菌條件下完成。

血清和血漿標本均分成多個相同的小份。每種條件（表1）均檢測血清和血漿同樣的小份標本，以觀察儲存和凍融條件對檢測結果一致性的影響，比較血清和血漿標本檢測結果的一致性。每種條件均檢測3小份標本，以減少操作帶來的偶然誤差的影響。每份標本均按照ACh RAb試劑盒（RSR Ltd.，Cardiff，UK）的說明書用酶標儀（BIORAD-Model 680）進行平行孔檢測［2］。對每小份標本計算其兩平行孔抑制率的均值，作為該小份標本的抑制率。抑制率=100×﹝1—（λ）標本/（λ）陰性對照﹞。計算每種處理條件下3小份標本抑制率的平均值和標準差，以及該條件下結果的變異系數(shù)（coefficient of variability，），=（標準差/平均值）×100，可以反映檢查結果的穩(wěn)定性（批內聚集性）。

1.3 統(tǒng)計學處理 不同處理條件下（5組）抑制率比較采用單因素方差分析（ANOVA），判斷不同保存條件對結果一致性的影響。對總體差異有統(tǒng)計學意義者，運用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進一步進行多重比較。同一處理條件下的血清和血漿標本的抑制率比較采用配對 檢驗，以評價血清和血漿標本結果的一致性。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各種條件下的血清或血漿ACh RAb的抑制率值見表1。除了血漿標本在E條件外，其余各條件下各標本AChRAb抑制率的均小于10%。在不同條件下血清標本ACh RAb抑制率差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），進一步分析顯示D條件下抑制率高于其余條件。血漿標本ACh RAb的抑制率在不同條件下差異亦有統(tǒng)計學意義（＜0.05），進一步分析顯示D和E條件下的抑制率低于其余條件（＜0.05）。

表1 不同儲存條件和凍融次數(shù)對血清/血漿AChRAb抑制率的影響 （=3）

表1 不同儲存條件和凍融次數(shù)對血清/血漿AChRAb抑制率的影響 （=3）

注：與條件E比較，*＜0.05；與條件D比較，#＜0.05；值、值為血清和血漿標本結果比較所得

處理條件 血清均值 標準差血漿均值 標準差值值A —80℃保存8 d 62.9#4.57 7.3 60.3*#2.3 3.8 0.69 0.560 B —80℃保存8 d，分別于第1、3和5天溶解1次，每次均于4℃保存1 h后再次冷凍62.1#1.85 3 60.1*#3.13 5.2 1.74 0.224 C 在—80℃保存8 d，分別于第1、2、3、5和7天溶解1次，每次均于4℃保存1 h后再次冷凍59.4#5.07 8.5 60.8*#3.75 6.2—0.76 0.528 D 4℃保存8 d69.4*1.44 2.1 51.7 3.69 7.1 6.69 0.021 E 室溫保存8 d 62 3.23 5.2 47.8 6.95 14.6 2.52 0.128

同一條件下血清和血漿標本抑制率除D條件血清標本抑制率高于血漿標本（＜0.05）外，其余處理條件下差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

3 討論

本研究所用標本為來自同一患者的同一標本，以期在其他方面相同的情況下觀察保存條件對AChRAb檢測結果一致性的影響，以及血清和血漿標本檢測結果的一致性。血清或血漿標本均含有降解酶，在4℃、室溫或低溫儲存條件下，標本中的蛋白類分子的降解程度可能存在不同，導致抗體蛋白含量減少和/或結合能力下降。血清和血漿的主要區(qū)別在于血漿含有豐富的纖維蛋白原，對一些生物分子有黏附作用，黏附的生物分子可能影響抗體的穩(wěn)定性和/或結合能力。

2010年，Hewer等［3］提出了一種新的ELISA方法，其特異性和敏感性與放射免疫沉淀法相近。該方法原理是將純化的胎兒型和成人型ACh R混合物包被在酶標板，待測血清中的ACh RAb與幾種不同的AChR單克隆抗體競爭性結合AChR。待測血清中ACh RAb濃度越高，其對生物素標記的AChR單克隆抗體結合的競爭性抑制越強，因此可以用抑制率反映ACh RAb的水平。由于該方法方便可靠且逐漸普及，本文作者采用該ELISA試劑盒檢測ACh RAb，初步觀察不同保存條件對ACh RAb檢測結果一致性的影響，以及對血清和血漿標本檢測結果的一致性的影響。

本實驗標本檢測所得到的AChRAb抑制率均顯著高于16%的陽性界值，也低于本研究所用ELISA試劑盒說明書中標準曲線的高限［2］。大部分處理條件下小于10%，即使直接儲存于—80℃并在隨后反復凍融多達5次的標本檢測結果也較為一致。然而，常溫放置8 d的血漿標本的超過10%。有研究報道，在不同儲存條件和反復凍融后檢測血清中水通道蛋白4抗體（antiaquaporin-4 antibody，AQP4Ab）水平，發(fā)現(xiàn)常溫運送標本和經(jīng)過反復凍融并未使血清中AQP4抗體的穩(wěn)定性降低［4］。本實驗除了4℃保存血清標本的抑制率略偏高外，其余處理條件下血清抑制率差異無統(tǒng)計學意義。因為該條件下的很小，而其余4種條件下的中有些較大，推測該條件下結果偏高可能是由于偶然誤差所致。血清標本檢測結果提示血清標本在常溫或4℃保存8 d后其抗體水平均能保持相對穩(wěn)定，抗體水平亦未受到標本冷凍后反復凍融的影響。

本實驗血漿標本在D和E處理條件下的抑制率較其余3種條件下低，而A、B和C條件下差異無統(tǒng)計學意義。當血漿標本儲存于4℃或常溫時，前述機制使AChRAb穩(wěn)定性下降的原因可能是D和E條件下抑制率低。血清和血漿標本結果的絕對差在D和E條件下較大，導致無法使用常溫或4℃保存的血漿標本代替血清標本進行檢測。而直接保存于—80℃的血清和血漿標本即使經(jīng)過多達5次凍融，其ACh RAb水平檢測結果差異也無明顯變化。

本研究結果提示，臨床檢測ACh RAb水平時，血清標本可在常溫、4℃或冷凍保存，血漿標本需要冷凍保存，檢送標本前先分離血清或血漿且于采血后數(shù)日內完成檢測均可得到可靠結果。而且，血清和血漿標本在—80℃保存即使經(jīng)過多達5次凍融也可以保持檢測AChRAb水平穩(wěn)定，在實驗室研究中需要成批檢測ACh RAb水平時使用冷凍的血漿標本代替血清標本可以獲得較為一致的結果。

［1］Gomez AM，Van Den Broeck J，Vrolix K，et al.Antibody effector mechanisms in myasthenia gravis-pathogenesis at the neuromuscular junction［J］.Autoimmunity，2010，43（5-6）：353-370.

［2］AChRAb ELISA Kit（96 wells）［EB/OL］.http：//www. rsrltd.com/IFU.html.

［3］Hewer R，Matthews I，Chen S，et al.A sensitive nonisotopic assay for acetylcholine receptor autoantibodies［J］.Clin Chim Acta，2006，364（1-2）：159-166.

［4］Jarius S，Wildemann B.Effect of storage conditions and freeze/thaw cycles on aquaporin-4 antibody（NMO-IgG）serum levels［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49（12）：2121-2122.

LI Hai-feng，Email：drlhf@163.com

Objective To evaluate the intra-assay reproducibility of anti-acetylcholine receptor antibody（ACh RAb）level in serum and plasma samples among various pre-treatment conditions consisting of different storage schemes and subsequent freeze/thaw cycles.Methods The serum and plasma samples were collected from a patient with myasthenia gravis and allocated in aliquots pre-treated in various conditions（stored at room temperature［RT］，4℃or—80℃with subsequent freeze/thaw cycles）.Each aliquot was examined in duplicate with commercial ACh RAb ELISA kit.The coefficient of variability（）was calculated for inhibition rate of AChRAb in each pre-treatment condition.Inhibition rates of AChRAb in serum or plasma samples were compared among each condition，and compared between serum and plasma samples in each condition.Results Except for plasma sample at RT，thes of all the other samples in various conditions were＜10%。The inhibition rate of AChRAb in serum sample was significantly higher at 4℃than those in other conditions（＜0.05）.The inhibition rate in plasma samples were significantly higher at 4℃and RT than those in other conditions（＜0.05）.There were significant difference in inhibition rates between serum and plasma samples at 4℃（＜0.05），while no difference was found in frozen conditions with up to five subsequent freeze/thaw cycles（＞0.05）.Conclusions There was good intra-test reproducibility of the ELISA kit in determining the AChRAb levels in serum and plasma samples stored at—80℃directly with various subsequent freeze/thaw cycles.There was good intra-test reproducibility in serum samples stored at RT，4℃and frozen conditions and in plasma samples stored in frozen conditions，which were examined in several days after blood collection.

myasthenia gravis；acetylcholine receptor antibody；storage condition；freeze/thaw

R746.1

：A

：1006-2963（2014）06-0394-03

2013-08-09）

（本文編輯：鄒晨雙）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.004

國家自然科學基金資助項目（81070963，30700242）；山東省自然科學基金資助項目（ZR2010HM019）

100034北京大學第一醫(yī)院神經(jīng)內科神經(jīng)免疫室（郝洪軍）；266003青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內科（洪宇）；100050首都醫(yī)科大學友誼醫(yī)院神經(jīng)內科（謝琰臣）；250012山東大學齊魯醫(yī)院神經(jīng)內科（李海峰）

李海峰，Email：drlhf@163.com