胡文舜等

摘 要 選用枇杷野生近緣種‘櫟葉枇杷和栽培種‘早鐘6號、‘香妃，對其葉綠體基因組trnH-psbA基因間隔區(qū)進行PCR克隆與測序，利用生物信息學方法分析其序列特征，并構建蘋果亞科內(nèi)19個屬的系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明：trnH-psbA序列長323～392 bp（GenBank登錄號：KF022254、KF022255、KF022256），G+C含量30.10%～33.13%，共有1個核苷酸替換（substitution）和2個插入/缺失（indel）；基于trnH-psbA DNA條形碼序列的分子系統(tǒng)進化分析結果表明，蘋果亞科內(nèi)形成2個大的分支，枇杷屬與石斑木屬的親緣關系最近（平均遺傳距離為0.055）。此結果表明葉綠體基因trnH-psbA序列可有效地進行枇杷屬內(nèi)物種鑒別及屬間分類，是枇杷屬植物DNA條形碼研究的標準基因之一。

關鍵詞 枇杷屬；trnH-psbA；DNA條形碼；序列分析；系統(tǒng)進化

中圖分類號 S667.3 文獻標識碼 A

Sequence Variation of trnH-psbA Barcode in Two Eriobotrya Plants and Phylogenetic Relationships with Related Genera

HU Wenshun1，2， JIANG Jimou1，2， HUANG Aiping2，3，

XU Qizhi1，2， CHEN Xiuping1，2， ZHENG Shaoquan1，2*

1 Fruit Research Institute， Fujian Academy of Agricultrual Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China

2 Fujian Breeding Engineering Technology Research Center for Longan&Loquat， Fuzhou， Fujian 350013， China

3 Information Institute of Agricultural Economy and Scitechnological， Fujian Academy of Agricultural

Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract The chloroplast genome trnH-psbA intergenic regions of three loquat（wild relatives‘E.prinoides，cultivars‘Zaozhong No.6and‘Xiangfei）were cloned and sequenced. The sequence characteristics were analyzed using bioinformatics methods and the phylogeny evolution tree was constructed with 19 genus of Maloideae. The results showed that the length of trnH-psbA sequence was 323～392 bp（GenBank accession number： KF022254， KF022255， KF022256）， and its G+C content was 30.10%～33.13%. A total of 1 substitution and 2 indels were obtained in the data. Molecular phylogenetic anaylised based on the sequence of trnH-psbA DNA barcode reflected the relationship between Eriobotrya and Rhaphiolepis was closer（the average genetic distance was 0.055）， and Maloideae was divided into two large branches. This paper suggested that trnH-psbA DNA barcode could be used as one of the standard gene to identify or classify plants of the Eriobotrya and its relative genus.

Key words Eriobotrya；TtrnH-psbA；DNA barcode；Sequence analysis；Phylogeny evolution

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.003

枇杷屬（Eriobotrya）隸于薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），分布于亞洲溫帶和亞熱帶地區(qū)；屬內(nèi)植物約有30種，其中中國原產(chǎn)的有16個種加5個變種或變型[1-2]。該屬植物不僅是一類庭院觀賞或綠化樹，其栽培種枇杷果實甜酸適度、營養(yǎng)豐富、具有極高的藥用價值。由于長期自然繁衍和人工選擇，變異類型較多，從形態(tài)學鑒別該屬所有植物的難度較大[3]。因此，對其準確地鑒別是進行有效保護利用的重要前提。

DNA條形碼技術（DNA barcoding）是利用標準的、具有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段對物種進行快速準確的鑒定方法[4]，是近年來動物[5]、微生物[6]、植物[7]等生物多樣性及分類研究熱點。DNA片段序列在枇杷屬植物的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中亦有相關報道。符小敏等[8]應用matK、trnL-F和ITS序列對廣東分布的香花枇杷、臺灣枇杷、大花枇杷和普通枇杷等4個種的分類地位和系統(tǒng)關系進行研究，結果顯示分子DNA序列數(shù)據(jù)能將香花枇杷和大花枇杷相區(qū)別。李平等[9]通過對rbcL、trnL-F、ITS和Adh基因進行序列分析，建立了枇杷屬12個種的分子系統(tǒng)發(fā)生樹。張坤城等[10]利用matK序列及ITS序列探討臺灣枇杷、武威山枇杷及恒春山枇杷之親緣關系，認為三者在分子親緣演化上并無明顯分化，建議將武威山枇杷及恒春山枇杷處理為臺灣枇杷的變型。王云生等[11]對栽培枇杷與野生枇杷葉綠體基因組的TrnS-TrnG和TrnQ-rps16位點進行序列多態(tài)性的比較，結果發(fā)現(xiàn)栽培枇杷群體在這2個基因位點不存在變異，而野生群體存在替代及插入/缺失變異。葉綠體DNA trnH-psbA片段是進化速率最快的葉綠體基因間隔區(qū)之一[12]，具有較高的物種鑒別能力。目前，未見針對枇杷野生種與栽培種的trnH-psbA序列分析及應用報道。

本研究選取枇杷野生近緣種‘櫟葉枇杷和栽培種‘早鐘6號（紅肉）、 ‘香妃（白肉）3份材料，對其trnH-psbA基因片段進行克隆與序列分析，并利用生物信息學方法構建蘋果亞科19個屬的系統(tǒng)發(fā)育樹，以探討trnH-psbA基因序列在枇杷屬植物物種鑒定上的有效性，為枇杷屬植物的DNA條形碼研究和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年3月在國家果樹種質(zhì)福州枇杷圃采集枇杷[E. japonica（Thunb.）Lindl.]品種‘早鐘6號、‘香妃及其野生近緣種櫟葉枇杷（E. prinoides Rehd. et Wils.）共3份樣品的嫩葉。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及質(zhì)量檢測 試驗在福建省龍眼枇杷育種工程技術研究中心實驗室進行。稱取新鮮葉片0.5 g，加入液氮迅速研磨。基因組DNA提取參照改良的CTAB法[13]，DNA質(zhì)量和濃度的檢測采用1%的瓊脂糖電泳。

1.2.2 PCR擴增與測序 trnH-psbA片段擴增引物及反應體系參考Wang等[14]的方法，引物序列trnH5′-ACTGCCTTGATCCACTTGGC-3′和psbA5′-CGAAGCTCCATCTACAAATGG-3′。PCR擴增反應總體積為50 μL，其中DNA模板50～100 ng，1× buffer（含Mg2+），dNTPs 0.8 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L，EX Taq聚合酶1.0 U。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

用OMEGA試劑盒（OMEGA BioTek）進行目的片段割膠回收，送樣進行直接測序，同時進行克隆測序：pMD18-T載體4 ℃連接過夜，然后轉化宿主菌DH5α并37 ℃培養(yǎng)過夜；經(jīng)藍白斑篩選、PCR檢測后，每個樣本挑選陽性克隆3個雙向測序。經(jīng)初步的序列分析，對存在單一突變的樣本進行重復PCR和測序，以減少因錯配得到的核苷酸變異。獲得3條序列的GenBank登錄號見表1。

1.2.3 序列統(tǒng)計分析 從GenBank上選取蘋果亞科19個屬的trnH-psbA序列19條，并與本實驗測序的3條序列一起進行ClustalX2.0多重比對后，手工刪去兩端多余序列及中間插入片段，從而獲得長度一致的序列用于比較分析。

采用MEGA5.05計算序列間的堿基組成、變異位點數(shù)、轉換/顛換數(shù)、遺傳距離等，并應用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。對分支的可靠性評價使用靴帶值（bootstrap， 1 000次重復）分析， K-2P參數(shù)遺傳距離（kimura-2parameter genetic distance）， 空位（gap）被處理為缺失（missing）。

2 結果與分析

2.1 枇杷trnH-psbA序列測定結果

以3份材料基因組DNA為模板，PCR擴增葉綠體trnH-psbA基因間隔區(qū)序列，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后在約400 bp處出現(xiàn)一清晰目的條帶（圖1），片段割膠回收后直接送樣測序。

PCR產(chǎn)物直接測序出現(xiàn)雙峰或噪值高等問題，結果差。最終通過TA克隆測序獲得枇杷屬植物葉綠體trnH-psbA序列共3條（圖2），將其在NCBI上進行BLAST相似性檢索，均有較好的匹配程度，確認所測序列為目標序列，檢索比對結果表明測序結果準確可靠。

2.2 枇杷trnH-psbA序列特征及分析

測定獲得早鐘6號、香妃、櫟葉枇杷的cpDNA基因的trnH-psbA片段長度分別為392、392、323 bp（表1）。從表1中可以看出，在trnH-psbA序列中4種堿基頻率存在明顯偏差，其中C含量最低，T含量最高，G+C含量為30.10%～33.13%，顯著低于其相應的A+T含量。由圖2可知，2個枇杷品種的trnH-psbA完全相同，而野生種櫟葉枇杷與栽培種相比有3個變異位點：在第178 bp位點和第224 bp位點處分別發(fā)生18和51 bp的缺失/插入；在第319 bp位點處發(fā)生G/T堿基的顛換。

2.3 基于trnH-psbA序列條形碼鑒定枇杷屬內(nèi)物種及其近緣屬

22條trnH-psbA序列經(jīng)過ClustalX2.0軟件比對排列后長度為250 bp，分析結果顯示，樣品間遺傳距離范圍為0～2.008，平均遺傳距離為0.346 8；枇杷屬普通枇杷種內(nèi)3個樣品之間遺傳距離最小為0，歐楂屬與石楠屬遺傳距離最大為2.008；枇杷屬與石斑木屬植物遺傳距離較小為0.006～0.053，推測二者親緣關系較近；根據(jù)trnH-psbA序列條形碼的特征性變異位點能全部區(qū)分蘋果亞科內(nèi)的19個屬植物。

由圖3可知，蘋果亞科內(nèi)19個屬明顯分為2個分支，第Ⅰ分支自展支持率高達99%，包含枇杷屬、栒子屬、紅果樹屬等17個屬，3份普通枇杷以98%的高支持率聚為一小的分支，野生種櫟葉枇杷和石斑木屬關系最近；第Ⅱ分支為歐楂屬和火棘屬，與其它屬距離均較遠，處于最靠近根目錄的位置。

3 討論與結論

本研究對trnH-psbA DNA條形碼在枇杷屬栽培種和野生近緣種上的序列特征及其適用性進行分析研究。試驗初期曾進行PCR擴增產(chǎn)物的直接測序，測序過程出現(xiàn)雙峰或信號中斷等問題。此外，作者對枇杷屬內(nèi)其它7個種23份材料進行了PCR產(chǎn)物直接測序驗證（將另文報道），同樣支持進行克隆測序以獲得完整的trnH-psbA序列。本試驗結果獲得的3條trnH-psbA序列在不同種間存在明顯的堿基顛換和插入/缺失突變，說明枇杷屬植物在長期栽培馴化過程中產(chǎn)生了較大變異。本研究基于trnH-psbA序列構建蘋果亞科19個屬的系統(tǒng)進化樹，DNA序列來自葉綠體基因組的單個基因，其結果會有一定的片面性，但仍具參考意義：如歐楂屬和火棘屬置于蘋果亞科系統(tǒng)演化樹的較早分支，這與Eugenia等[15]綜合利用葉綠體11個基因和核基因ITS序列分析蘋果亞科內(nèi)27個屬331個種的系統(tǒng)發(fā)育研的究結果相一致；枇杷屬與石斑木屬二者親緣關系較近，這與之前符小敏等[8]、張坤城等[10]、Eugenia等[15]的研究報道相吻合。因此，枇杷屬植物葉綠體基因trnH-psbA序列具有長度適中、容易擴增、測序成本較低等優(yōu)點，能有效地鑒別屬內(nèi)物種及屬間分類，可作為DNA條形碼標準基因。

植物DNA條形碼研究和應用可以分成2個階段：（1）條形碼的選擇和確定；（2）將選定的條形碼應用于物種鑒定，逐步建立完整的條形碼數(shù)據(jù)庫[16-17]。枇杷屬植物類群中條形碼的研究和應用尚處于探索階段，充分利用基因組信息尋找理想的DNA條形碼候選基因仍是今后一段時間主要的研究任務。通過對枇杷屬內(nèi)多個類群和多個基因的比較，結合傳統(tǒng)形態(tài)分類學，開展分類群種內(nèi)和種間差異、物種鑒別的分子變異尺度、不同條形碼的使用范圍、系統(tǒng)發(fā)育相關的進化事件等方面研究工作，最終建立實用的條形碼數(shù)據(jù)庫。這不僅可以實現(xiàn)快速、準確的物種鑒定，也為揭示中國枇杷屬植物的生物多樣性及更好地保護利用提供科學依據(jù)。

致謝 本研究部分實驗在福州國家水稻改良分中心完成，期間得到了連玲助理研究員、何煒助理研究員的幫助，特此感謝！

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責任編輯：黃東杰