榮霞等

摘 要 以來源于橄欖成熟胚的橄欖試管苗為材料，進行PPO基因克隆，比較試管苗不同保存階段PPO基因轉(zhuǎn)錄水平和PPO酶活性的變化。結(jié)果表明：克隆獲得1個PPO基因全長cDNA序列，命名為PPO2，GenBank登錄號為JQ319005，cDNA全長序列為1 934 bp，推測出橄欖PPO開放閱讀框（ORF）1 818 bp，編碼606個氨基酸。橄欖PPO2屬于堿性、親水、非分泌蛋白，可能定位于線粒體基質(zhì)空間，具有3個典型的保守結(jié)構(gòu)域，絲氨酸磷酸化占主導(dǎo)地位，并且二級結(jié)構(gòu)以不規(guī)則卷曲為主。而三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，橄欖試管苗PPO2蛋白主要由α螺旋和不規(guī)則卷曲組成；進化樹分析顯示橄欖PPO蛋白與胡楊PPO關(guān)系最近，而與葡萄和蓮的親緣關(guān)系較遠；qPCR分析顯示，PPO2基因在橄欖試管苗不同保存階段都有表達，但在橄欖試管苗保存1個月幼葉比較多時PPO2基因的表達量最高；而橄欖試管苗在分別保存1、2、3、4、5個月時PPO活性變化趨勢不明顯，當保存時間到6、7、8個月時PPO活性急劇增加。因此，PPO基因可能與幼嫩組織的啟動分化有關(guān)，并在橄欖試管苗生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞 橄欖；PPO；克??； qPCR；酶活性

中圖分類號 S667.5 文獻標識碼 A

Cloning and Expression of Polyphenol Oxidase（PPO）Gene

During Different Process of Preservation in in vitro

Chinese Olive（Canarium album）

RONG Xia， LAI Zhongxiong*， LIN Yuling， LIU Shengcai

LAI Gongti， CHEN Yukun， ZHANG Zihao

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract Chinese olive test-tube plantlets germinated from mature embryo were used as the experiment materials. Cloning and analysis of PPO， the transcriptions of PPO at different preservation stages in in vitro Chinese olive plantlets were studied，and the activity of PPO enzyme was also determined. The results indicated that 1 934 bp full-length cDNA sequence of PPO gene was obtained. It was registered in GenBank， and the accession number was JQ319005. The cDNA contained a 1 818 bp open reading frame（ORF）， encoding 606 amino acids. Besides， a partial sequence of PPO was obtained（PPO1， JF811036）. The predict of the protein showed PPO2 was alkaline， hydrophilic and non-secretory. PPO2 protein contained three typical conserved domains and might localize in mitochondrial matrix space. Serine predominance in phosphorylation， secondary structure was mainly as irregular curl. Three-dimensional structure prediction showed that Chinese olive in vitro plantlets PPO2 protein was surrounded with α-helice and irregular curl. Phylogenetic tree analysis of PPO2 showed there was a close relationship with Populus euphratica， but with a long distance with Vitis vinifera and Nelumbo nucifera. The analysis of qPCR showed preservation for 1 month， the plantlets with more young leaves， and the PPO2 gene expression was at the highest level. PPO activity of Canarium album plantlets changed slightly after preservation for 1～5 months； after preservation for 6～8 months， the PPO activity increased sharply. This research suggested PPO gene might be associated with the initiation of differentiation of tender tissue and organ， and PPO likely played an important role in the process of plantlet growth and development in Canarium album.

Key words Canarium album； Polyphenol oxidase； Cloning； qPCR； Enzymatic activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.021

橄欖（Canarium album L.）屬于橄欖科橄欖屬，又稱青果、白欖、山欖等，是中國南方特有的亞熱帶果樹之一，廣泛分布于福建、廣東、廣西、貴州等省（區(qū)）[1]。橄欖不僅果實營養(yǎng)物質(zhì)豐富，還是重要的藥用植物[2]。據(jù)《本草綱目》記載，橄欖具有健脾胃、助消化、止泄瀉、生津止渴、清熱解毒等功效[3]，還具有降壓、抗癌、抗菌消炎等作用。橄欖是一種多年生常綠高大喬木，四季常青，樹形美觀，對綠化、美化環(huán)境很有價值。但由于童期長、品種結(jié)構(gòu)失調(diào)、缺乏遺傳背景資料，近年橄欖種質(zhì)資源流失越來越嚴重，常規(guī)育種工作進展緩慢。

橄欖含有大量的酚類物質(zhì)，其離體培養(yǎng)過程有不同程度的褐化出現(xiàn)，且橄欖褐變與保鮮等關(guān)系很密切，受多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）影響，多酚氧化酶通過分子氧氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醌，從而導(dǎo)致褐變。多酚氧化酶屬核編碼含銅金屬酶，能催化一元酚及多元酚到聯(lián)苯酚的羥基化及羥基酚到醌的脫氫反應(yīng)[4]。多酚氧化酶廣泛分布于植物的各種器官或組織中，以幼嫩部位含量高，而成熟部位較低[5]。PPO可分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶、漆酶等3大類[6]，目前PPO基因已在中國木瓜、菠蘿、甘薯、蘋果、葡萄、梨樹、楊樹、茶樹等20多種植物中克隆得到[7]，但是，龍眼、荔枝、橄欖、芒果等主要熱帶水果的PPO基因克隆一直未見報道。橄欖分子生物學方面的研究主要集中在分子標記研究[8-10]，王云梅[11]采用RT-PCR和RACE技術(shù)，從橄欖品種‘長營葉片中克隆得到黃酮合成相關(guān)基因C4H基因的全長及PAL和4CL基因的片段。但關(guān)于橄欖PPO的研究較少，而該基因的克隆及其相關(guān)分子生物學研究未見報道。鑒于此，本研究擬進行橄欖的PPO基因克隆，研究不同離體保存時間下PPO基因的定量表達及酶活性變化，可為橄欖多酚氧化酶的研究、褐變機制研究以及完善試管苗離體種質(zhì)保存方案提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

橄欖主栽品種‘惠圓，取自福建省福州市閩侯縣白沙鎮(zhèn)綠百合有限公司。將橄欖的成熟胚接種于MS培養(yǎng)基培養(yǎng)1個月時間，接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA，取試管苗葉片進行RNA提取經(jīng)反轉(zhuǎn)錄用于PPO基因克隆，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8個月的試管苗提取的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄用于Qpcr分析，同時，不同培養(yǎng)時間的試管苗葉片也用于PPO酶活性測定。

1.2 方法

1.2.1 橄欖試管苗總RNA提取 采用BioTeKe通用植物總RNA提取試劑盒提取橄欖試管苗葉片的總RNA，具體步驟按照說明書進行，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和采用Quawell UV-Vis Spectrophoto meter Q5 000測定其純度和含量，產(chǎn)物于-80 ℃超低溫冰箱保存并用于cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 橄欖試管苗PPO基因克隆 PPO基因保守區(qū)cDNA 第一鏈的合成具體操作參照張銳[12]的方法，3′RACE-cDNA第一條鏈的合成具體操作按照RevertAidTM first-strand cDNA synthesis Kit（Fermentas）說明書并作適當改進，接頭引物為5′-GCTGTCAA

CGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG（T）24-3′。5′RACE-cDNA合成具體操作參照陳義挺[13]的方法。PPO基因克隆分為4個步驟，依次是保守區(qū)、3′、5′和ORF克隆，設(shè)計用于不同擴增目的的引物見表1，PCR反應(yīng)程序為94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃ 變性30 s，退火（溫度根據(jù)不同引物而定）45 s，72 ℃延伸（時間根據(jù)擴增片段而定），36個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接轉(zhuǎn)化（DH5α感受態(tài)細胞）、重組子篩選及菌液PCR鑒定后，測序委托北京六合華大基因科技股份有限公司進行。測序結(jié)果應(yīng)用DNAMAN軟件和NCBI在線工具對橄欖PPO基因進行序列基本結(jié)構(gòu)和特征分析。

1.2.3 橄欖PPO基因的生物信息學分析 通過在線程序和軟件對橄欖PPO2基因所編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列進行生物信息學預(yù)測和分析，預(yù)測和分析參數(shù)有PPO2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、磷酸化位點、功能基序、卷曲螺旋、二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化樹分析，具體分析軟件和網(wǎng)站同林玉玲[14]一致，如下：

行分析。

1.2.4 橄欖PPO基因定量表達分析 以18S rRNA為內(nèi)參基因，檢測橄欖試管苗不同保存階段材料中目的基因PPO2在轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量?；谝芽寺〉拈蠙霵PO2基因的cDNA序列，設(shè)計的引物為PPO2-qF：5′-CCGCACAAGCATAAGCACGG

G-3′，PPO2-qR：5′-TGCGAGCAAGACCCTTCCCA

-3′，擴增目的片段為142 bp，以18S rRNA基因為內(nèi)參，引物序列參考高玉瓊[15]。qPCR反應(yīng)體系：EXPRESS SYBRR GreenER qPCR SuperMix Universal為10 μL、10 μmol/L PPO2基因特異上、下游引物各0.4 μL、不同樣本的cDNA（稀釋10倍）為1.0 μL，再加ddH2O為8.2 μL，包括不加模板的陰性對照。在羅氏LightCycler 480儀器上進行Real Time PCR反應(yīng)，PCR兩步法反應(yīng)程序為：預(yù)變性 95 ℃ 5 min；95 ℃變性10 s；65 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40 個循環(huán)；40 ℃冷卻30 s。內(nèi)參基因PCR體系，除引物不同外，其余參數(shù)同PPO基因，內(nèi)參基因的PCR反應(yīng)程序，除退火60 ℃外，其余參數(shù)同PPO基因。標準曲線制作，首先將9個樣本的cDNA模板進行混樣形成1倍混合樣，再將混合樣按照5倍梯度稀釋，形成5個不同濃度（1、5、25、125、625倍）混合樣模板，每樣本重復(fù)3次進行qPCR反應(yīng)。根據(jù)羅氏LightCycler 480熒光定量PCR得到的PPO2基因的Cp值及擴增效率等參數(shù)，利用Excel和geNorm軟件計算橄欖試管苗不同保存階段中PPO2基因的相對表達量。

1.2.5 橄欖試管苗不同保存時間PPO酶活性測定

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖試管苗PPO基因克隆

提取的橄欖試管苗總RNA，經(jīng)凝膠電泳檢測28 S和18 S的條帶清晰明亮，完整性好，純凈，無DNA污染，符合后續(xù)試驗要求。試驗經(jīng)保守區(qū)、3′和5′克隆分別獲得538、1130 bp和869 bp的序列，采用DANMAN6.0軟件對已經(jīng)獲得的保守區(qū)、3′RACE序列和5′RACE序列進行拼接。橄欖試管苗PPO2基因cDNA全長序列為1 934 bp，其中包含13 bp的5′UTR，100 bp的3′UTR，3′端還含有24 bp典型的poly（A）結(jié)構(gòu)。推測出橄欖PPO開放閱讀框（ORF）由1 818堿基組成，編碼606個氨基酸，以ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。經(jīng)ORF驗證得到的序列與拼接結(jié)果完全一致，在 NCBI網(wǎng)站上通過BLAST將橄欖PPO核苷酸序列進行同源性分析（圖1）。通過不同物種間PPO同源性比對，發(fā)現(xiàn)橄欖PPO基因序列與毛果楊（Populus trichocarpa，XM002316596.1）、蓖麻（Ricinus communis，XM002518970.1）、棗樹（Ziziphus jujube，HQ634289.1）、金花茶（Camellia nitidissima，F(xiàn)J597757.1）、核桃（Juglans regia，F(xiàn)J769240.1）的PPO基因的同源性分別為75%、74%、72%、70%、69%。因此，可證明已經(jīng)克隆獲得橄欖PPO基因，將此基因命名為PPO2，并在GenBank上登錄，登錄號為JQ319005。此外，本試驗獲得橄欖PPO基因家族另一成員376 bp的片段，命名為PPO1，登錄號為JF811036。

2.2 橄欖PPO2基因的生物信息學分析

經(jīng)分析，PPO2基因編碼蛋白質(zhì)分子式為C3 079H4 741N835O897S20；分子質(zhì)量為68.45 ku；理論等電點為8.47，屬于堿性、親水性蛋白。PPO2蛋白不含有信號肽，預(yù)測其可能為非分泌蛋白，橄欖PPO2蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白，可能存在由內(nèi)到外或由外到內(nèi)的雙向跨膜的2個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。PPO2蛋白定位于線粒體基質(zhì)空間的可能性最大，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示PPO2具有3個典型的保守結(jié)構(gòu)域，一是約138～152個氨基酸長度的高度保守序列基序：kfdv，稱為C-末端結(jié)構(gòu)域；二是常見的中央域酪氨酸酶，酪氨酸酶結(jié)合兩個銅離子（CUA、CUB）。且兩個銅離子通過兩套3個保守的組氨酸殘基進行結(jié)合；三是多酚氧化酶中間域：約50個氨基酸長度保守的DWL-序列（圖2）。

磷酸化預(yù)測可知橄欖PPO2基因編碼的蛋白可能在15個Ser、9個Thr、6個Tyr氨基酸位點發(fā)生磷酸化修飾，因此推測Ser、Thr、Tyr磷酸化位點可能會通過影響PPO2蛋白的活性和分子構(gòu)象等方面，參與調(diào)控橄欖離體種質(zhì)保存過程不同階段的生長發(fā)育，而且絲氨酸磷酸化占主導(dǎo)地位。其他功能基序分析顯示PPO2蛋白含有一個酪氨酸酶CuA結(jié)合區(qū)域（位于208～225：Tyrosinase CuA-binding region）和酪氨酸酶CuB結(jié)合區(qū)域（位于366～377：Tyrosinase and hemocyanins CuB-binding region）。橄欖PPO2蛋白在氨基酸序列492～519區(qū)域最有可能形成卷曲螺旋，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測到橄欖PPO2蛋白中α螺旋為15.02%、延伸鏈為14.85%和不規(guī)則卷曲為70.13%。不規(guī)則卷曲均勻散布于整個蛋白質(zhì)中，它是橄欖PPO2蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件。用SWISS-MODEL服務(wù)器對橄欖PPO2基因編碼的蛋白質(zhì)進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖3）從分析結(jié)果可得PPO2蛋白的三維結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、延伸鏈和不規(guī)則卷曲組成，并呈較均勻分布。

2.3 橄欖PPO2系統(tǒng)進化樹分析

為了解橄欖PPO2蛋白與其它植物PPO蛋白的進化關(guān)系，本研究對橄欖PPO2蛋白進行多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析，建立不同植物PPO氨基酸序列系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果表明：與楊柳科楊屬胡楊亞屬的胡楊、胡桃科胡桃屬的胡桃、鼠李科棗屬的棗親緣關(guān)系較近，其中與胡楊最近，而與睡蓮科、葡萄科、山茶科的親緣關(guān)系較遠。

2.4 橄欖試管苗不同保存階段PPO2基因相對定量表達分析

熒光定量PCR結(jié)果如圖5，PPO2基因在橄欖試管苗不同保存階段都有表達，橄欖試管苗保存1個月幼葉比較多，PPO2基因的表達量相對最高，同時保存1個月的MS培養(yǎng)基的橄欖試管苗只有子葉胚變綠，未長新葉，PPO2基因的表達量很低，保存2、3月時隨著葉的成熟PPO2基因表達量下降，保存4個月時，隨著側(cè)芽的萌動PPO2基因表達量迅速上升，5個月急劇下降，保存6個月時側(cè)芽生長旺盛，幼葉增多，PPO2基因表達量又急劇上升，保存7個月稍有下降，保存8月時，橄欖試管苗有衰老跡象，PPO2基因表達量上升。因此，PPO表達水平與橄欖幼嫩器官的形成和發(fā)育關(guān)系密切。

2.5 橄欖試管苗不同保存階段PPO酶活性變化

分析橄欖試管苗保存過程中不同階段的PPO酶活性的變化（圖6），從圖中看出橄欖試管苗在分別保存1、2、3、4、5個月時PPO活性變化趨勢不明顯，保存時間到6、7、8個月是急劇增加，其中5月份到6月份PPO酶活性變化幅度最大。總體上，隨著試管苗保存時間的延長，橄欖PPO活性呈升高的趨勢。在橄欖試管苗保存過程中伴隨有側(cè)芽和幼嫩器官的形成，隨著保存時間的延長，試管苗母株由于受到養(yǎng)分供應(yīng)的限制，總體上呈衰老的狀態(tài)。因此PPO活性與橄欖植株衰老密切相關(guān)，并且可能與橄欖器官更新存在相互影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 橄欖PPO基因特性

橄欖PPO屬于多基因家族。大多數(shù)植物的PPO基因都屬于多基因家族，如番茄有7個編碼 PPO的核基因[17]；馬鈴薯中，編碼PPO的核基因至少有6個[18]；蠶豆至少有4個基因編碼PPO；小麥的PPO至少由3個不同的基因編碼[19]。本試驗克隆得到橄欖PPO基因的2個成員（PPO1和PPO2），因此確定橄欖PPO基因也屬于多基因家族，但該家族有多少成員，有待進一步研究。包括橄欖在內(nèi)的大多數(shù)植物的PPO基因無內(nèi)含子，如杏[20]、美國商陸[21]等，而Paul[22]在單子葉植物香蕉果肉中發(fā)現(xiàn)1個含85 bp內(nèi)含子的PPO基因。而本研究中橄欖品種福州惠圓的試管苗葉片的PPO2基因不存在內(nèi)含子序列。

植物PPO基因序列有很高的同源性，且都有編碼銅結(jié)合部位的保守功能區(qū)域。不同植物之間的PPO可能在直接與銅離子結(jié)合的組氨酸保守基序，是完全一致的[23]。本試驗對橄欖PPO基因的核苷酸序列和蛋白序列與其它物種的同源性都在60%以上，而且對其蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)橄欖的PPO2基因同樣包含2個含銅的高度保守區(qū)（CuA、CuB）。植物多酚氧化酶基因序列的2個銅保守區(qū)的同源性都很高，這是多酚氧化酶的主要功能區(qū)[24]。本試驗的橄欖PPO2蛋白在208～225處含有1個酪氨酸酶CuA結(jié)合區(qū)域，在366～377處含有1個酪氨酸酶CuB結(jié)合區(qū)域，這些功能域是植物PPO基因的主要功能區(qū)。

3.2 橄欖試管苗離體保存過程中PPO的作用

PPO基因表達的種類及表達的量因植物種類、部位及生長發(fā)育階段的不同而有所不同。同一植物也存在不同的信號傳導(dǎo)途徑來啟動PPO基因，使PPO基因選擇性地在不同條件下表達，植物的同一器官的不同發(fā)育時期，PPO基因的開啟或關(guān)閉及表達量均有差異[25-26]。一般正在發(fā)育生長的幼嫩組織和器官，如幼葉、花等的PPO mRNA轉(zhuǎn)錄水平都較高，而成熟組織，如成熟的葉子、莖等的PPO mRNA含量則相對較少[27]。葡萄的研究中幼嫩的處于成長階段的漿果、葉片、根部PPO基因表達量高，而多酚氧化酶mRNA在葉片發(fā)育的晚期，其表達量很低[28]。馬鈴薯葉片的PPO mRNA含量不同，只有幼嫩的葉片能檢測到[18]。本試驗證明在發(fā)育生長的橄欖幼嫩組織（幼葉、幼嫩的側(cè)芽等）中PPO的表達量較高，而成熟葉片則較低，此觀點與前人研究一致。由此推測，PPO基因很可能與幼嫩組織的啟動分化有關(guān)并在橄欖試管苗生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

張紅梅等[29]發(fā)現(xiàn)PPO可促進傷口的愈合。橄欖莖段被切割接種時，細胞中的酚、酶的區(qū)域化分布被打破，有氧條件下，組織切口表面的酚類物質(zhì)變?yōu)轷愇镔|(zhì)，此時，PPO可能促進了傷口的愈合。由此可知，PPO基因?qū)﹂蠙煸嚬苊珉x體保存過程起到非常重要的作用。本試驗中橄欖試管苗在保存8個月時，有衰老跡象，但PPO基因的轉(zhuǎn)錄表達量卻增加，這說明PPO基因可能間接參與細胞的凋亡。所以，可以通過降低PPO的表達量，來延長橄欖試管苗離體保存的時間，其機理有待進一步研究。本試驗發(fā)現(xiàn)，PPO酶活性在不同保存階段下的變化趨勢與PPO基因熒光定量表達變化規(guī)律不一致?？赡躊PO酶活和其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達量在不同發(fā)育時期或不同組織內(nèi)，不存在對應(yīng)性，也就是說PPO活性高的區(qū)域，其 mRNA信號卻較低，這一點在杏樹的研究中已經(jīng)證明[18]。其一，可能是不同發(fā)育時期的蛋白穩(wěn)定性不同，或某些組織更適合PPO mRNA的翻譯[30]。其二，可能是從mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程還受到復(fù)雜的調(diào)控[14]，這些都有可能造成基因的轉(zhuǎn)錄表達量和酶活性之間的差異。

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