景曉輝等

摘 要 為研究苜蓿（Medicago truncatula）防衛(wèi)素基因MtDef4的抑菌功能，以含有該基因片段的質(zhì)粒pAND-MtDef4為模板，擴增出相應(yīng)的目的基因，測序正確后將MtDef4基因片段連接到帶有GST標(biāo)簽的原核表達載體 pGEX6P-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TransB（DE3），經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)，Glutathione Sepharose 4B親和純化，通過SDS-PAGE電泳及Western blot確定融合蛋白的表達。體外抑菌試驗表明，MtDef4能夠抑制病原真菌Corynespora cassiicola 而非Collectotrichum gloeosporioides的生長。本研究結(jié)果可為進一步培育轉(zhuǎn)基因橡膠抗病品種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 苜蓿防衛(wèi)素基因；原核表達；抗真菌活性；多主棒孢菌；膠孢炭疽菌

中圖分類號 Q782 文獻標(biāo)識碼 A

The Purification of GST-MtDef4 Fusion Protein and

Detection of Its Antifungal Activity in vitro

JING Xiaohui1， WU Lunying1 *， SHEN Yan2，3 *， ZHAO Hui4 * *， WU Lin5

1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource / College of Agronomy， Hainan University， Haikou，

Hainan 570228， China

2 Key Laboratory of Tropical Horticultural Plant Resources and Genetic Improvement， Ministry of Education / College of

Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 571737， China

3 Coconut Research Institute，CATAS，Wenchang，Hainan 571339， China

4 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience

and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

5 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract MtDef4 was amplified from pAND-MtDef4 by PCR， and cloned into vector pGEX-6P-1 with glutathione-S-transferase（GST）tag. After identified by restriction endonuclease digestion and sequencing， the recombinant plasmids pGEX-6P-1-MtDef4 were transformed into Escherichia coli TransB（DE3）， an efficient strain to guarantee the correct fold of disulfide bond. The recombined cells were grown and induced by IPTG. After purification using glutathione sepharose 4B affinity chromatography， the expressed protein was separated by SDS-PAGE and detected by western blot. The results showed that the MtDef4-GST fusion protein was successfully expressed. Antifungal assay indicated that MtDef4-GST fusion protein could inhibit the growth of a filamentous fungus Corynespora cassiicola but not Collectotrichum gloeosporioides.

Key words Medicago truncatula Defensin gene MtDef4； Prokaryotic expression； Antifungal activity； Corynespora cassiicola； Collectotrichum gloeosporioides

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.018

由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的橡膠樹棒孢霉落葉?。–orynespora leaf fall disease，CLFD）現(xiàn)已成為南亞、東南亞和中非橡膠樹最具破壞性的葉部病害[1-2]。據(jù) Chee[3]估計，該病一旦嚴(yán)重發(fā)生，膠樹產(chǎn)量損失將達20%。2006年6月Pu等[4]首次在海南西慶農(nóng)場的橡膠樹苗圃上采到疑似病樣，至2007年9月已在海南的12個市（縣）發(fā)現(xiàn)該病的危害。該病蔓延速度相當(dāng)快，已經(jīng)成為中國天然橡膠健康發(fā)展的潛在威脅。由膠孢炭疽菌 [Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz. and Sacc.]引起的炭疽病是中國橡膠樹的另一重要病害，直接會導(dǎo)致橡膠樹葉片組織壞死或大量脫落，樹體衰弱，縮短割膠期限，最終總產(chǎn)量顯著下降[5]。中國每年發(fā)生面積超 20萬hm2，造成干膠損失近1萬t[6]。目前還未見有效的化學(xué)農(nóng)藥可用于防治棒孢霉落葉病或炭疽病。傳統(tǒng)的抗病品種選育是最有效的防治方法，但抗性種質(zhì)資源有限，且選育新品種周期過長。而轉(zhuǎn)基因育種有常規(guī)育種不具備的優(yōu)勢，可用于培育廣譜高效的抗性品種。

植物防衛(wèi)素是一類廣泛分布的抗真菌蛋白，成熟肽含有45～54個氨基酸，有8個保守的半胱氨酸，形成4個二硫鍵[7-8]。體外實驗中發(fā)現(xiàn)，多個植物防衛(wèi)素可在微摩爾濃度下抑制半活體寄生型（hemibiotrophic）或腐生型（necrotrophic）真菌的生長[8-10]，如苜蓿（Medicago truncatula）防衛(wèi)素MtDef4能夠抑制包括Fusarium graminearum在內(nèi)的多個真菌生長[11-14]。Gao等[15]采用轉(zhuǎn)MtDef4基因技術(shù)轉(zhuǎn)化馬鈴薯取得對馬鈴薯黃萎?。╒erticillium dahliae）不錯的田間防效，因而有一定的潛力用于抗病育種。本研究擬利用原核表達技術(shù)純化MtDef4，研究其體外抑制橡膠多主棒孢菌和炭疽病菌生長的能力，為將來轉(zhuǎn)基因培育抗病橡膠品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗于 2012年7月至2013年3月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所進行。質(zhì)粒pAND-MtDef4由Dilip Shah教授惠贈。大腸桿菌菌株為本實驗室保存的E. coli DH5α，表達載體為本實驗室保存的pGEX6P-1，表達菌株為TransB（DE3）。多主棒孢菌HCCHN01和膠孢炭疽菌Y262由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所黃貴修實驗室提供。

1.1.2 試劑 PCR 反應(yīng)所用試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化公司，TransB（DE3）感受態(tài)、anti-GST直接購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Bradford 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 MtDef4基因片段的回收純化 根據(jù)MtDef4開放閱讀框序列設(shè)計帶有酶切位點的引物MtDef4-F：CACGAATTCATGGCTAGGTCCGTGCCACTC（劃線顯示引入的EcoRI位點），MtDef4-R ATACTCGAGTT

AGCAGTGGGTGGTGCAGAAGC（劃線顯示引入的XhoⅠ位點）。PCR程序為 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR條帶大小。

1.2.2 原核表達載體的構(gòu)建 獲得的目的片段經(jīng)純化后用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，在T4 DNA連接酶作用下連接到以相同酶切后回收的 pGEX6P-1載體上，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性的LB平板上挑取重組質(zhì)粒，通過 PCR、雙酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆測序驗證。構(gòu)建成功的表達質(zhì)粒命名為pGEX6P-1-MtDef4，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TransB（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 挑取測序正確的單克隆接種到5 mL LB（100 μg/mL Amp）培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h后，將菌液按1 ∶ 100的比例加入到500 mL LB（100 μg/mL Amp）培養(yǎng)基中 200 r/min 37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時，加入IPTG（使終濃度為1 mmol/L）進行誘導(dǎo)表達，20 ℃誘導(dǎo)16 h后收集菌液，4 000 r/min離心15 min收集菌體后用1×PBS將沉菌懸起，經(jīng)過超聲波細(xì)胞破碎（20 mm的變幅桿，400 W，超聲3 s，間隔5 s，重復(fù)50次），13 000 r/min離心10 min，上清保存-20 ℃?zhèn)溆?。pGEX6P-1作為陰性對照。

1.2.4 GST-MtDef4的純化、SDS-PAGE及western blot檢測 預(yù)冷的PBS處理谷胱甘肽瓊脂糖樹脂，50 mL保存的上清液中加入1 mL預(yù)處理的樹脂，4 ℃顛倒混勻1 h，1 000 r/min離心5 min棄上清，預(yù)冷的PBS溶液清洗谷胱甘肽樹脂數(shù)次，洗凈未與樹脂結(jié)合的雜蛋白，1 mL還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫GST-MtDef4和GST。利用Bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。稀釋500倍后，分別取10 μL GST-MtDef4和GST加入SDS上樣緩沖液，混勻，沸水浴3 min，進行SDS-PAGE（5%濃縮膠，12%分離膠），然后利用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，anti-GST檢測蛋白表達情況。

1.2.5 原核表達產(chǎn)物抑菌活性的檢測 配制含50 μmol/L GST-MtDef4的PDA培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中間打孔，接種多主棒孢病菌和膠孢炭疽菌塊，28 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察多主棒孢病菌和膠孢炭疽菌的生長情況。50 μmol/L GST的PDA培養(yǎng)基為對照。GST-MtDef4抑菌率計算公式為：（含GST的PDA培養(yǎng)基上菌落直徑-含GST-MtDef4的PDA培養(yǎng)基上菌落直徑）/含GST的PDA培養(yǎng)基上菌落直徑×100%。所有數(shù)據(jù)采用SigmaPlot作圖，所有試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達載體pGEX6P-1-MtDef4的構(gòu)建及鑒定

用帶有酶切位點的引物進行PCR擴增，得到MtDef4基因的cDNA編碼區(qū)序列。電泳檢測結(jié)果表明與片段預(yù)期大小相一致，且無非特異擴增帶（圖1-A）。將目的片段回收純化后，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，連接到pGEX6P-1上，獲得pGEX6P-1-MtDef4原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α。對重組質(zhì)粒進行 PCR及雙酶切鑒定，都能獲得1條長約250 bp的條帶（圖1-B），與預(yù)期大小一致。將目的條帶測序，序列比對結(jié)果正確，表明pGEX6P-1-MtDef4原核表達載體已構(gòu)建成功。然后將鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TransB（DE3）中，進行蛋白誘導(dǎo)。

2.2 GST-MtDef4的western blot檢測

重組質(zhì)粒pGEX6P-1-MtDef4轉(zhuǎn)化表達菌株TransB（DE3）后，用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達，谷胱甘肽瓊脂糖樹脂進一步純化后，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后利用anti-GST進行western-blot檢測。pGEX6P-1作為陰性對照。從圖2可以看出，利用TransB（DE3）菌株成功表達出GST和GST-MtDef4，GST和GST-MtDef4的大小分別約為26 ku和37 ku。利用Bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，將GST和GST-MtDef4終濃度調(diào)整為1 mmol/L。

2.3 原核表達產(chǎn)物抑菌活性的檢測

28 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察多主棒孢病菌和膠孢炭疽菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)在含有50 μmol/L GST-MtDef4的PDA平板上，多主棒孢病菌生長緩慢，平均菌落直徑為（3.6±0.2）cm，而膠孢炭疽菌生長正常，平均菌落直徑為（9±0.12）cm（圖3-C）；而在含有50 μmol/L GST的PDA平板上，多主棒孢病菌和膠孢炭疽菌都生長正常，菌落直徑分別為（9±0.2）和（9±0.15）cm（圖3）。GST-MtDef4在50 μmol/L時顯著抑制多主棒孢病菌生長，抑制率達到60%（p<0.05），GST-MtDef4在50 μmol/L時對膠孢炭疽菌的生長無顯著影響。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的主要挑戰(zhàn)之一是如何能夠獲得對真菌病害高效且持久抗性的品種[16-17]。盡管各種作物中已經(jīng)培育出許多抗病品種并應(yīng)用于田間生產(chǎn)，但抗病品種不夠多，抗性易喪失或者對有些病害沒有抗病品種等，導(dǎo)致每年由真菌病害造成的損失使作物減產(chǎn)10%[17]。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破自然界物種間原有的生殖隔離，促進基因在不同物種間的交流，增大遺傳多樣性，可用于培育廣譜高效的抗性品種。

植物抗微生物蛋白（plant antimicrobial proteins，AMPs）也被稱為防衛(wèi)素（defensin），是在整個植物界分布廣泛的富含半胱氨酸的堿性肽，對多種植物真菌病原菌具有廣譜抗性[18]。體外的抑菌活性以及防衛(wèi)素的廣泛分布性表明其可能在植物先天免疫中扮演重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿和擬南芥中至少有300個類防衛(wèi)素肽[19-21]，水稻中93個類防衛(wèi)素肽[22]。苜蓿防衛(wèi)素MtDef4能夠抑制包括Fusarium graminearum在內(nèi)的多個真菌生長[14]。目前的研究表明，植物防衛(wèi)素的抗真菌活性主要取決于γ-core motif[14，23]。利用MtDef4的γ-core motif替換MsDef1的γ-core motif，能夠提高MsDef1的2倍抑菌活性[14]。甚至僅僅合成MtDef4的γ-core motif也能夠抑制真菌生長[14]。

植物防衛(wèi)素能夠抑制植物及人類病原真菌的生長，但它們對植物和人類本身完全無毒。植物防衛(wèi)素很可能通過靶向真菌細(xì)胞膜的獨特位點進而發(fā)揮功能。先前的研究表明，植物防衛(wèi)素特異結(jié)合敏感真菌的細(xì)胞膜[24]，刺透細(xì)胞膜進而抑制真菌生長[25]。有學(xué)者認(rèn)為一些植物防衛(wèi)素特異性地結(jié)合敏感真菌細(xì)胞膜上的特異鞘脂類（sphingolipids），鞘脂類是植物防衛(wèi)素的受體[24]。一些真菌對植物防衛(wèi)素表現(xiàn)出抗性很可能是這些真菌細(xì)胞膜上并不含有這類的鞘脂。然而現(xiàn)階段并不清楚防衛(wèi)素/鞘脂互作后是怎樣影響真菌生長的，真菌細(xì)胞膜上是否存在除鞘脂類之外的受體，真菌體內(nèi)是否存在特定的信號級聯(lián)。有關(guān)植物防衛(wèi)素作用機理的另一主要問題是真菌細(xì)胞是否內(nèi)吸植物防衛(wèi)素，導(dǎo)致防衛(wèi)素在真菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)合特定靶標(biāo)。van der Weerden[26]發(fā)現(xiàn)Nicotiana alata防衛(wèi)素NaD1能夠被真菌細(xì)胞內(nèi)吸。NaD1首先結(jié)合位于真菌細(xì)胞壁上的受體，進而在Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum細(xì)胞膜上形成直徑為14～22 A。的小孔，并刺透細(xì)胞膜。

Gao等[15]采用轉(zhuǎn)MtDef4基因技術(shù)轉(zhuǎn)化馬鈴薯取得對馬鈴薯黃萎?。╒erticillium dahliae）不錯的田間防效，本研究成功將MtDef4基因與GST標(biāo)簽融合表達于大腸桿菌TransB（DE3）中，體外抑菌實驗表明，MtDef4-GST融合蛋白能夠抑制橡膠多主棒孢菌的生長，而未能抑制橡膠膠孢炭疽菌的生長，其可能的原因是橡膠多主棒孢菌而非膠孢炭疽菌的細(xì)胞膜上存在特異識別MtDef4的鞘脂，導(dǎo)致MtDef4能夠與橡膠多主棒孢菌互作，進入多主棒孢菌細(xì)胞。然而具體的抑菌機制值得進一步研究，以期為培育轉(zhuǎn)基因抗病橡膠品種奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

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