楊光華 劉進(jìn)平

摘 要 以文心蘭切花品種“黃金2號”（Oncidium Gower Ramsey ‘Gold2）為材料，通過RT-PCR和RACE技術(shù)，從文心蘭的花中分離得到了1個ACO基因成員的cDNA，命名為OnACO1（GeneBank登錄號為JQ822088）。

中圖分類號 Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Cloning and Expression Analysis of OnACO1 Gene in Oncidium

YANG Guanghua1，2，LIU Jinping1*

1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources，

Hainan University， Ministry of Education/College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228，China

2 Sanya Science &Technology Academy for Crop Winter Multiplication， Sanya， Hainan 572000，China

Abstract A member of ACO gene family， OnACO1（GeneBank accession number JQ822088） was cloned from Oncidium Gower Ramsey ‘Gold2‘ by RT-PCR and RACE technology. The full length cDNA is 1 424 bp with an ORF of 972 bp encoding 324 amino acids， a 172 bp 5′-UTR and a 280 bp 3′-UTR. The deduced amino acid sequence of OnACO1 shares high homology with those of other orchid species. Vector pGEX-OnACO1 was constructed and transformed into E. coli BL21. Prokaryotic expression and SDS-PAGE indicated that a specific band of OnACO1 expression was in consistent with the predicted protein size. Quantitative PCR analysis showed there was a tissue-specific pattern of OnACO1 expression， mainly in gynostemium， and the expression was upregulated by ethylene.

Key words Oncidium；OnACO1；RACE；Gene cloning；Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.014

文心蘭（Oncidium）又名舞女蘭、跳舞蘭、金蝶蘭、瘤瓣蘭，因其花色鮮黃，花型別致，花姿優(yōu)美，是世界上重要的切花品種，具有較高的觀賞價值。栽培的文心蘭切花品種以黃色、多花性、中花型的切花品種——南茜（Oncidium Gower Ramsey）及其變異種為主[1]。隨溫度和季節(jié)不同，文心蘭切花壽命在1周左右?；ǘ渌ダ峡炻蛪勖L短是評價觀花植物品質(zhì)好壞的一個重要指標(biāo)，對其進(jìn)行研究有重要的理論價值和實踐意義。

蘭科植物花朵的衰老過程為典型的呼吸躍變型，乙烯是主要的調(diào)控因子[2]。乙烯合成途徑中ACC氧化酶（ACO）可催化ACC向乙烯轉(zhuǎn)化，為乙烯形成的關(guān)鍵限速因子。鑒于乙烯生物合成相關(guān)基因在調(diào)控花卉衰老和果品完熟方面的重要意義，采用生物技術(shù)尋找與花卉保鮮性能相關(guān)的目的基因， 從遺傳物質(zhì)上進(jìn)行改造，對從根本上解決花卉保鮮及抗衰老問題具有重要意義[3]。迄今為止，已在康乃馨[4-9]、百合[10-12]、蝴蝶蘭[13]等花卉中進(jìn)行ACO基因克隆及基因轉(zhuǎn)化研究。本研究對文心蘭切花品種‘黃金2號ACC氧化酶基因的全長cDNA進(jìn)行克隆和表達(dá)分析。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 材料來源 文心蘭“黃金2號”（Oncidium Gower Ramsey ‘Gold2）購自海南博大蘭花公司。

1.1.2 材料處理 摘取文心蘭的根、莖、葉和花朵，用液氮研磨，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫挥靡蚁├磕ㄎ男奶m花部，并套袋處理一定時間，取文心蘭的唇瓣、花瓣、花萼和蕊柱同樣用液氮研磨，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 質(zhì)粒及菌株 克隆載體pMD18-T Vector購自Takara公司。E.coli DH5α、BL21以及表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-1由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所彭世清課題組惠贈。

1.1.4 主要生化試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit、限制性內(nèi)切酶FastDigest Bam HI和FastDigest Sal Ⅰ購自Fermentas公司，3′-full RACE Core Set、5′-full RACE Core Set、Taq DNA聚合酶、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq、DL 2 000 DNA Marker均購自Takara公司，ACC購于OMEGA公司。其他生化試劑和常規(guī)試劑均為超純和分析純。

1.1.5 引物 實驗中所設(shè)計的引物（表1）全部委托上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）合成。

1.2 方法

1.2.1 文心蘭總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 采取CTAB法[14]分別提取文心蘭的根、假鱗莖、葉、唇瓣、花瓣、花萼、蕊柱的總RNA，經(jīng)電泳檢測條帶完整無降解。以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行actin引物擴(kuò)增檢測。

1.2.2 OnACO1克隆與序列分析 （1）OnACO1克隆：①采用改良CTAB法提取文心蘭花部總 RNA，電泳檢測其完整性后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit（Fermentas）的操作說明合成第一鏈cDNA，擴(kuò)增actin基因檢測cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄效果。②根據(jù)GeneBank上已登錄的石斛蘭（AF038840）、卡特蘭（AY598793）、蝴蝶蘭（AF004662）等蘭科植物ACO氨基酸的保守區(qū)域設(shè)計一對簡并引物ACO-1和ACO-2，以第一鏈 cDNA為模板，進(jìn)行目的基因的中間片段PCR擴(kuò)增。③將獲得的DNA片段連接到pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，以LB/Amp平板培養(yǎng)后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行M13菌落PCR鑒定。④將鑒定的陽性克隆送Invitrogen公司測序。

（2）序列分析：①根據(jù)所獲得的保守序列測序結(jié)果分別設(shè)計3′-RACE特異引物ACO P31、ACO P32和5′-RACE特異引物ACO P51、ACO P52，并結(jié)合試劑盒中的兩端引物，參照Takara公司的3′-full RACE Core Set、5′-full RACE Core Set的操作說明，以cDNA為模板，通過巢式PCR的方法擴(kuò)增OnACO1基因的3′和5′末端。②PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后委托Invitrogen公司測序。③將中間片段、3′末端和5′末端的測序結(jié)果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）后進(jìn)行Blast比對，確定為ACO基因同源序列后，用DNAMAN軟件將三者進(jìn)行拼接得到OnACO1基因的全長序列。④通過軟件 DNAMAN 和 Bioedit 分析推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種ACC氧化酶氨基酸序列的同源性，利用 MEGA 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 OnACO1基因的克隆

2.1.1 OnACO1基因各片段序列的擴(kuò)增 以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，所獲得的目的基因中間片段約800 bp大?。▓D1，A），經(jīng)測序分析得出其長度為855 bp。通過Blast在線比對，得知它們與其它已知的ACO基因有較高的同源性，確定其為ACO基因片段。分別以ACO P31和3′-RACE Outer Primer， ACO P32和3′-RACE Inner Primer為引物，文心蘭花部cDNA為模板進(jìn)行3′-RACE擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，克隆獲得約700 bp的目的條帶（圖1，B）。而后分別以ACO P51和5′-RACE Outer Primer，ACO P52和5′-RACE Inner Primer為引物，文心蘭花部cDNA為模板進(jìn)行5′-RACE擴(kuò)增，結(jié)果顯示克隆獲得約500 bp的目的條帶（圖1，C）。

2.1.2 OnACO1基因全長序列的擴(kuò)增 將已經(jīng)獲得的OnACO1基因的5′ 端、3′ 端和中間片段用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，得到OnACO1基因的全長cDNA。以ACO_orf F和ACO_orf R為引物，對OnACO1基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步對拼接序列進(jìn)行驗證。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2，A），結(jié)果表明條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致?；厥漳康钠尾⑵渑c18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，測序結(jié)果表明克隆出的基因序列與拼接得出的OnACO1基因序列一致（圖3）。

2.2 OnACO1基因序列的生物信息學(xué)分析

經(jīng)生物軟件分析和Blast在線分析可知，所獲得的OnACO1基因序列全長為1 424 bp，包括972 bp的ORF，172 bp的5′ UTR和280 bp的3′ UTR，以起始密碼子ATG開始，以終止密碼子TGA結(jié)束，編碼324個氨基酸，該氨基酸序列與文心蘭（Oncidium hybrid cultivar，AET75832）、石斛蘭（Dendrobium hybrid cultivar，ABK32881）、卡特蘭（Cattleya hybrid cultivar，BAF36562）和蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrid cultivar，AAR00506）的ACO氨基酸序列同源性分別達(dá)92%、84%、83%、82%。聚類分析結(jié)果表明，該氨基酸殘基序列與蘭科植物的序列聚為一支（圖4）。這些結(jié)果表明，所獲得的序列為ACC氧化酶基因序列，考慮到它們可能都是基因家族中的一員，將其命名為OnACO1（GeneBank登錄號為JQ822088）。

2.3 OnACO1基因的原核表達(dá)

2.3.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 為了進(jìn)一步了解文心蘭OnACO1基因的功能，對其進(jìn)行了原核表達(dá)分析。將OnACO1-pMD18-T重組質(zhì)粒分別經(jīng)Bam HI和SalⅠ酶切后回收OnACO1片段，與同樣經(jīng)過Bam HI和SalⅠ酶切的pGEX-6P-1連接，轉(zhuǎn)化DH5α，得到新的重組質(zhì)粒。對該重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切（圖2，B）和測序鑒定，結(jié)果表明目的片段已經(jīng)插入到表達(dá)載體中，將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體命名為pGEX-OnACO1。

2.3.2 原核表達(dá)分析 將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pGEX-OnACO1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于37 ℃條件下用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h后，在SDS-PAGE中顯示出特異性表達(dá)條帶（圖5），與預(yù)測的蛋白大小基本一致。

2.4 OnACO1基因的表達(dá)分析

以根部的表達(dá)量為參照，OnACO1在文心蘭蕊柱中的表達(dá)量最高，其次是花瓣和花萼，唇瓣、根、莖和葉中的表達(dá)量均很低（圖6）。用1%的乙烯利各處理文心蘭花部0、6、12、24、48 h，摘取蕊柱，分別提取總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以Actin作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR。結(jié)果表明用乙烯利對文心蘭進(jìn)行處理后，蕊柱中OnACO1基因的表達(dá)在處理24 h時上調(diào)效果比較明顯（圖7）。

3 討論與結(jié)論

目前植物基因克隆的方法比較多，本研究采用了同源克隆結(jié)合RACE的方法擴(kuò)增目的基因的全長cDNA，但其在實際操作中存在不少的困難：（1）簡并引物是多序列的混合物，由于其序列的不確定性，引物的特異性必然會降低，反應(yīng)底物的溶度和退火溫度就必須經(jīng)過多次摸索。史兆興等[17]在反應(yīng)條件的優(yōu)化中，總結(jié)出在起先的4～5個循環(huán)中設(shè)置低于常規(guī)溫度5～10 ℃的退火溫度，在隨后的循環(huán)中再提高到正常的退火溫度，這樣有利于簡并PCR的進(jìn)行。本研究在利用簡并引物擴(kuò)增ACS基因的中間目的片段時，采用特定的退火溫度進(jìn)行PCR難以取得理想的效果，因此在對PCR條件的優(yōu)化實驗中，先進(jìn)行了5個循環(huán)的低溫退火，然后再進(jìn)行30個循環(huán)的高溫退火，擴(kuò)增出了較好的目的條帶。（2）5′ RACE中3個連續(xù)的酶促反應(yīng)（反轉(zhuǎn)錄，TdT加尾和PCR擴(kuò)增）每一步都可能導(dǎo)致實驗的失敗；即使酶促反應(yīng)順利，也容易產(chǎn)生大量的非特異性擴(kuò)增。鄧雪柯等[18]比較優(yōu)化3種RACE法（環(huán)化法、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶法和SMART反轉(zhuǎn)錄酶法）的擴(kuò)增效果，結(jié)果表明RACE技術(shù)能較好地解決非特異性擴(kuò)增和錯配等問題，但其對RNA的質(zhì)量有更高的要求。本研究選用Takara公司的3′-full RACE Core Set和5′-full RACE Core Set進(jìn)行巢式PCR，電泳顯示幾乎沒有非特異性擴(kuò)增，獲得比較單一的目的條帶。

在已有報道的基因中，ACO基因具有920～990 bp的開放閱讀框，編碼大約320個氨基酸，其中石斛蘭ACO基因（ABK32881）編碼324個氨基酸，卡特蘭ACO基因（BAF36562）編碼324個氨基酸。文心蘭OnACO1基因有972 bp的開發(fā)閱讀框，經(jīng)Blast比對后，OnACO1基因序列與卡特蘭、石斛蘭、蝴蝶蘭的ACO序列同源性分別達(dá)88%、86%、86%。這些結(jié)果表明本研究克隆出的文心蘭OnACO1基因是ACO基因家族中的典型成員。

熒光定量PCR結(jié)果表明OnACO1基因主要在蕊柱中表達(dá)，而在其他組織中基本不表達(dá)，這與張憲省等[19-21]研究的蝴蝶蘭表達(dá)模式具有一致性。在用乙烯利處理文心蘭蕊柱和花萼的實驗中，分別以未被處理的文心蘭蕊柱和花萼為對照，乙烯利對OnACO1基因的表達(dá)起到了上調(diào)作用。這些都表明OnACO1基因可能在文心蘭花衰老中發(fā)揮重要作用。

ACC氧化酶基因是多基因家族[22-23]，同一基因家族中不同基因的表達(dá)模式可能會有很大的差別。本研究只分析了ACO基因家族中的一個基因，目前正在克隆ACO基因家族的其他成員，今后將對ACO基因在文心蘭切花衰老調(diào)控中的表達(dá)變化和功能進(jìn)行深入探討。

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