何訪等

摘 要 利用染色體步移的方法克隆了一種白木香倍半萜合酶——愈創(chuàng)木烯合酶基因（AsSGS）791 bp的啟動子序列，序列分析表明，獲得的序列中A/T含量達64.6%，與真核生物啟動子序列的特征相符合。該序列除具有啟動子核心序列TATA-box和增強子元件CAAT-box等典型的真核生物啟動子基本元件外，還含有如赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif、ABA的應(yīng)答元件G-Box、生長素響應(yīng)元件TGA-element和脫落酸響應(yīng)元件ABRE等參與激素調(diào)控元件，光應(yīng)答元件Box I、GA-motif、TCT-motif，熱脅迫反應(yīng)的HSE，厭氧誘導(dǎo)元件ARE和增強誘發(fā)厭氧反應(yīng)的GC-motif等順式作用元件。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本生煙草瞬時表達系統(tǒng)對所獲得的啟動子功能進行鑒定，結(jié)果表明，所有缺失片段都能驅(qū)動β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因表達，GUS活性與啟動子片段的長度呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞 白木香；倍半萜合酶；啟動子；染色體步移；瞬時表達；β-葡萄糖苷酸酶

中圖分類號 Q943.2 文獻標(biāo)識碼 A

Cloning and Function Analysis of the Sesquiterpene Guaiene

Synthase Gene（AsSGS）Promoter in Aquilaria sinensis

HE Fang1，2， MEI Wenli2， LI Huiliang2， GUO Dong2， PENG Shiqing2 *， DAI Haofu2 *

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience

and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract An approximately 791 bp genomic DNA fragment of AsSGS promoter from Aquilaria sinensis was cloned using Genome Walker strategy. Sequence analysis indicates that the content of A and T in the obtained sequence is 64.6%，which is correspond with the characteristics of eukaryotic promoter sequence. The sequence not only contain TATA box，CAAT-box and other core configurations，but also has several eukaryotic cis-regulatory elements，such as GARE-motif，G-Box，TGA-element，ABRE，Box I，GA-motif，TCA-motif，HSE，ARE and GC-motif. The functions of the obtained promoter were identified by using Agrobacterium-mediated transient expression system. GUS activity analysis revealed that all 5' deletions fragment of the AsSGS promoter could drive the expression of GUS gene in Nicotiana benthamiana plants. The GUS activity was positively correlated with the length of the promoter fragment.

Key words Aquilaria sinensis； Sesquiterpene synthases； Promoter； Genome walking； Transient expression； β-Glucuronidase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.017

沉香是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬植物在受到傷害后產(chǎn)生的含有樹脂的木材[1]，是一種傳統(tǒng)的名貴藥材和天然香料，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等[2]。健康的沉香屬植物并不產(chǎn)生沉香，只有通過自然因素（雷劈、火燒、蟲蛀等）或人為因素（砍傷、打洞、接菌等）的作用，沉香才會在植物中逐漸形成[2-3]。對于沉香的結(jié)香機制目前雖有一些假說，但還缺乏科學(xué)依據(jù)[1]。白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg]是中國生產(chǎn)沉香的唯一植物資源，該植物是一種熱帶、亞熱帶常綠喬木，現(xiàn)已被列為國家二級瀕危保護植物，在中國海南、廣東、廣西、福建、臺灣等?。▍^(qū)）均有分布[3]。

研究結(jié)果表明，倍半萜是沉香的主要特征性成分[4-7]，對倍半萜生物合成和表達調(diào)控的研究將有助于對沉香形成機制的理解。倍半萜的生物合成是由兩分子的異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和一分子的二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）反應(yīng)生成法呢基焦磷酸（farnesyl-pyrophosphate synthase，F(xiàn)PP），然后FPP在倍半萜合酶的作用下合成相對應(yīng)的倍半萜[8-12]。愈創(chuàng)木烯合酶（Sesquiterpene guaiene synthases，SGS）催化FPP合成愈創(chuàng)木烯倍半萜類化合物。Kumeta等[13]克隆了Aquilaria crassna中的SGS基因，進行相關(guān)的表達研究；Xu[14]等克隆了白木香愈創(chuàng)木烯合酶基因（Aquilaria sinensis Sesquiterpene guaiene synthases，AsSGS），分析了白木香樹受傷前后AsSGS的表達變化，但AsSGS的表達調(diào)控機制的研究鮮見報道。本研究利用染色體步移的方法克隆了AsSGS啟動子并利用瞬時表達系統(tǒng)對其功能進行初步鑒定，這為進一步研究AsSGS表達調(diào)控機制，闡明沉香的結(jié)香機制及倍半萜的生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白木香樹干組織采集于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所區(qū)內(nèi)5年生白木香樹。本生煙草（Nicotiana benthamiana）種子、大腸桿菌（E. coli）DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、pCAMBIA1381Z和pCAMBIA1301植物表達載體由本實驗室保存。用于構(gòu)建染色體步移文庫的試劑盒LA PCRTM in vitro Cloning Kit、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4連接酶、IPTG和X-gal等均購于TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購于QIAGEN公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒購于Real-Times公司。

1.2 方法

1.2.1 染色體步移文庫的構(gòu)建 白木香DNA的提取參照趙翱等[15]的方法。染色體步移文庫的構(gòu)建按照TaKaRa公司LA PCRTM in vitro Cloning Kit使用說明書進行。使用5種產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶（Sau3AⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、MflⅠ、XbaⅠ）分別對白木香樹基因組DNA進行酶切消化，并對酶切消化后的DNA進行純化。然后把純化的DNA與試劑盒提供的接頭連接，構(gòu)建成5種染色體步移文庫（Sau3AⅠ庫、HindⅢ庫、EcoRⅠ庫、MflⅠ庫、XbaⅠ庫）。

1.2.2 引物的設(shè)計 根據(jù)AsSGS的序列（GenBank登錄號：KC149961）設(shè)計2條反向巢式PCR特異引物S1（5′-CAGCAGAAGTTCCACAATCTGAGCCA

CC-3′）和S2（5′-CAAGAAGTTGGAAGA ATGA GTG

AGGA-3′）；試劑盒提供引物C1（5′-GTACATATTG

TGGTTAGAACGCGTAA TACGACTCA-3′）和C2（5′-GTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGG GAGA

-3′）作為正向引物進行巢式PCR。

1.2.3 AsSGS啟動子的分離 第1輪PCR反應(yīng)：在5個0.25 mL PCR管中分別加入5種DNA文庫0.5 μL，然后依次加入10×LA PCR 緩沖液Ⅱ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTPs 2 μL，引物C1 1 μL，引物S1 1 μL、LA Taq 0.5 μL，補水至20 μL?；靹蚝笫紫仍?4 ℃預(yù)變性3 min，然后在94 ℃ 30 s，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min 進行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。第2輪PCR反應(yīng)：分別取第1輪PCR產(chǎn)物1 μL稀釋500倍作為第2輪PCR反應(yīng)的模板，然后依次加入10×LA PCR緩沖液Ⅱ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTPs 2 μlL，引物C2 1 μL，引物S2 1 μL、LA Taq 0.5 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。混勻后進行如下PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，在 94 ℃ 30 s，58 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min 20 s進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收、純化后克隆到pMD19-T載體上并送北京諾賽生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 序列生物信息學(xué)分析 利用Neural Network Promoter Prediction在線對AsSGS基因的啟動子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)進行分析（http：//www.fruitfly.org/seq_

tools/promoter. html）；利用Plant CARE軟件（http：

//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE軟件（http：//www. dna.affrc. go.jp/PLACE/signalup.html）對分離的基因啟動子的調(diào)控元件進行在線分析。

1.2.5 AsSGS啟動子的5′缺失體植物表達載體的構(gòu)建 根據(jù)已獲得的基因啟動子的序列設(shè)計引物，并將雙酶切位點引入不同長度5′缺失的啟動子。設(shè)計引物如下：

正向引物：P1：5′-atcggatccAGCTTTAATGCAG

CAAAACCAGCAGC-3′

P2：5′-atcggatccGAGCTTTAGAAG

TACAAAGTTGTTAC-3′

P3：5′-atcggatccCATTTGGATATCA

TCTACTAACCCAC-3'

P4：5′-atcggatccATTGAATTATTTT

CACCCAAACGTGT-3′

P5：5′-atcggatccGCAAGTGCGCTT

TCTAGTGCAGCCAT-3′

反向引物：R：5′-cggaagcttTTTTCTGTTCTTTT

GGTGCAAAAGCA-3′

PCR分別擴增含酶切位點不同大小的5′缺失啟動子片段，并將它們分別克隆到PMD19-T載體上，測序驗證。

選擇pCAMBIA1381Z作為瞬時表達載體，分別對表達載體和插入了缺失啟動子片段的PMD19-T載體進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切效果。T4連接酶將表達載體和缺失片段連接起來，用載體引物PCR對構(gòu)建好的表達載體進行驗證。構(gòu)建好的植物載體如圖1。

1.2.6 植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草 分別將驗證好的5個重組質(zhì)粒、pCAMBIA1381Z和pCAMBIA1301質(zhì)粒用電融合法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，pCAMBIA1381Z載體引物PCR驗證陽性克隆。將驗證正確的單菌落擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加懸浮液（MES+MgCl2+AS）靜置2 h，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法轉(zhuǎn)化本生煙草，28 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.2.7 GUS染色和GUS活性檢測 GUS染色：取3片轉(zhuǎn)化了表達載體的本生煙草，加入GUS蛋白染色液，24 h后用75%酒精進行脫色。

GUS定量測定：取0.1 g煙草樣品用液氮磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，加入400 μL蛋白抽提緩沖液（50 mmoL/L磷酸緩沖液pH7.0、0.1% Triton X-100、0.1% SDS；10 mmoL/L β-巰基乙醇、10 mmoL/L Na2-EDTA），混勻，冰上靜置10 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清，此上清即為總蛋白提取液。采用Bradford[16]法測定總蛋白濃度，將總蛋白提取液與考馬斯亮藍溶液反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定其總蛋白濃度。采用Jeferson[17]法測定GUS蛋白活性，結(jié)果以所生成的4-MU的量與總蛋白含量和時間的比值pmol/mg·min表示。所有試驗至少重復(fù)3次[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AsSGS啟動子的克隆

通過2輪PCR擴增后，在HindⅢ和EcoRⅠ 2個文庫中擴增出清晰的條帶（圖2），將HindⅢ庫中擴增獲得的較大片段克隆到載體后測序。測序結(jié)果分析片段長為902 bp，其中111 bp序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中AsSGS的翻譯起始位點下游的序列完全一致，表明克隆了791 bp的AsSGS啟動子序列。序列分析表明獲得的序列中A/T含量高達64.6%，符合真核生物啟動子序列的特征。

2.2 AsSGS啟動子功能元件預(yù)測分析

對獲得的AsSGS啟動子序列進行功能元件預(yù)測分析表明，核心啟動子區(qū)域位于-109～-60 bp，其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點位于翻譯起始位點上游69 bp處。采用Plant CARE數(shù)據(jù)庫和植物順式元件查詢數(shù)據(jù)庫PLACE（圖3），對AsSGS啟動子的順式作用元件分析，結(jié)果顯示，該序列具有啟動子核心序列TATA-box和增強子元件CAAT-box等多個典型的真核生物啟動子基本元件。同時存在如赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif，ABA的應(yīng)答元件G-Box和ABRE，生長素響應(yīng)元件TGA-element等參與激素調(diào)控的應(yīng)答元件。同時還存在光應(yīng)答元件BoxⅠ、GA-motif、TCT-motif，熱脅迫反應(yīng)的HSE；厭氧誘導(dǎo)元件ARE和增強誘發(fā)厭氧反應(yīng)的GC-motif等順式作用元件（表1）。

2.3 植物表達載體的構(gòu)建

根據(jù)對AsSGS啟動子序列中順式作用元件分析結(jié)果設(shè)計引物，通過PCR擴增獲得不同長度的AsSGS啟動子片段（791、633、511、298 bp和154 bp）。將這些片段克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，與同樣經(jīng)過雙酶切的植物表達載體pCAMBIA1381Z連接，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，得到5個與預(yù)期大小一致的片段（圖4），并且對重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果表明插入片段序列正確，植物表達載體構(gòu)建完成，分別命名為pC-P1、pC-P2、pC-P3、pC-P4和pC-P5。

2.4 AsSGS啟動子功能初步鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法將構(gòu)建好的植物表達載體侵染本生煙草葉片，經(jīng)GUS蛋白染色發(fā)現(xiàn)，含有pC-P1、pC-P2、pC-P3、pC-P4和pC-P5植物載體的農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片都顯藍色，陽性對照pCAMBIA1301也顯藍色，陰性對照pCAMBIA1381Z不顯藍色，結(jié)果表明，所有片段都能驅(qū)動GUS的表達（圖5），-154 bp的P5片段可以驅(qū)動GUS的表達，說明預(yù)測的核心啟動子區(qū)域（-109～-60 bp）是正確的。

此外對含有pC-P1、pC-P2、pC-P3、pC-P4和pC-P5植物載體的農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片進行GUS蛋白活性定量分析，結(jié)果表明，所有缺失片段均具有活性。在缺失的啟動子中，隨著啟動子片段的大小的改變，GUS活性發(fā)生改變，GUS活性與啟動子片段的長度成正相關(guān)（圖6）。序列分析發(fā)現(xiàn)啟動子上在-722～-718 bp、-606～-601 bp、-402～

-398 bp、-376～-371 bp、-208～-204 bp等處有增強子元件CAAT-box，這可能是導(dǎo)致片段越長GUS活性越高的原因。但P4片段明顯高于P5片段，可能在-298～-155 bp區(qū)域有其他增強子元件，然而P3片段的活性又弱于P4片段，可能是在-511～-298 bp間存在抑制元件。

3 討論與結(jié)論

沉香作為名貴藥材和天然香料具有重要的經(jīng)濟價值，在自然條件下白木香結(jié)香時間很長，且含量低，提高沉香的產(chǎn)量對發(fā)展沉香產(chǎn)業(yè)具有重要意義。目前對白木香和沉香研究主要集中在相關(guān)化學(xué)成分分析及藥理的研究，而缺乏對沉香的生物合成及調(diào)控機制的研究。

Kumeta等[13]證明了越南沉香（Aquilaria crassna）中的SGS基因表達受茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)；Xu[14]等發(fā)現(xiàn)傷害處理可以誘導(dǎo)AsSGS表達，但二者均未對SGS的表達調(diào)控機制進行研究。啟動子是基因的一個重要組成部分，控制基因表達的起始時間和表達的程度，對研究基因表達調(diào)控具有重要的作用[19-20]。本研究克隆了791 bp的AsSGS的啟動子并進行功能的初步分析，發(fā)現(xiàn)AsSGS啟動子含有多種激素誘導(dǎo)應(yīng)答元件（如赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif，ABA的應(yīng)答元件ABRE，生長素響應(yīng)元件TGA-element），表明AsSGS的表達受多種激素調(diào)控，這是首次對白木香在沉香形成關(guān)鍵基因AsSGS表達調(diào)控的相關(guān)報道。

通過改變植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的表達來提高次生代謝物的產(chǎn)量已有報道，如在青蒿中過量表達法尼基焦磷酸合酶基因，青蒿素的含量與對照相比提高了4倍[21]；Daudonnet[22]等將來源酵母的法尼基焦磷酸合酶基因在煙草中超表達，固醇和胡蘿卜素的水平得到提高。如果在白木香樹中提高倍半萜合酶基因的表達量，就有可能提高白木香樹的倍半萜的量，從而提高沉香的產(chǎn)量。目前白木香樹的轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，通過轉(zhuǎn)基因在白木香樹中過量表達倍半萜合酶基因還很困難。但通過對AsSGS的調(diào)控機制的深入研究，明確AsSGS的表達調(diào)控機制，有可能通過激素或化學(xué)調(diào)控等方式調(diào)控AsSGS的表達。啟動子活性、基因表達和基因產(chǎn)物三者之間有緊密關(guān)系。通過提高啟動子的活性來增強倍半萜合酶基因的表達，產(chǎn)生更多的倍半萜合酶，最終增加倍半萜的產(chǎn)量，這為提高沉香的產(chǎn)量提供了可能。

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