高世超等

摘 要 由糖基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)對(duì)植物抵御和適應(yīng)環(huán)境的變化起著重要作用。為探討青花菜在酸雨脅迫下糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)變化，對(duì)青花菜β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的cDNA序列全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)分析。結(jié)果表明：青花菜β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的cDNA全長(zhǎng)為1 550 bp，開放閱讀框?yàn)? 155 bp，編碼384個(gè)氨基酸，推測(cè)分子式為C1964H3044N558O567S11，分子量為43 897.8，沒有信號(hào)肽。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，該青花菜基因與擬南芥聚類關(guān)系最近。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究模擬酸雨脅迫下β-1， 4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示該基因的表達(dá)量在模擬酸雨脅迫初期顯著增大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，又開始下降，這表明其在青花菜抗酸雨脅迫中發(fā)揮了作用。

關(guān)鍵詞 青花菜；β-1， 4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因；分子克隆；模擬酸雨；表達(dá)

中圖分類號(hào) S635.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning of β-1， 4 - xylosyltransferase IRX9H in Broccoli

（Brassica oleracea var. italica） and Its Expression

in Broccoli Under Simulated Acid Rain Stress

GAO Shichao， ZHONG Fenglin*， LIN Yizhang， ZHAO Ruili， LIN Junfang， YE Liping

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract Secondary metabolites catalyzed by glycosyltransferase played an important role in resisting and adapting to environmental changes for plants. The full-length cDNA of β-1，4-xylosyltransferase IRX9H was cloned in order to explore its expression in broccoli under acid rain stress， which was analyzed by bioinformatics method and real-time PCR. The results showed that the full-length DNA was 1 550 bp and the opening reading frame（ORF）was 1 155 bp. The ORF encoded 384 amino acids， a deduced formula of C1964H3044N558O567S11 with molecular weight 43 897.8， but no signal peptide. Phylogenetic tree analysis revealed that the gene of broccoli had closer relationship with that from Arabidopsis. The analysis by real-time PCR suggested that the expression of β-1，4-xylosyltransferase IRX9H genes in broccoli under simulated acid rain stress increased significantly at first，and then declined due to longer duration of simulated acid rain stress， which was involved in signalling pathways in response to the acid rain stress.

Key words Brassica oleracea；β-1，4-xylosyltransferase IRX9H；Molecular cloning；Simulated acid rain； Expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.020

青花菜（Brassica oleracea var. italica）又名青花椰菜、意大利花菜、意大利芥藍(lán)、木立花椰菜、綠花菜、莖椰菜、西蘭花，屬于十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物。甘藍(lán)種中以綠花球?yàn)楫a(chǎn)品的一個(gè)變種，以主莖及側(cè)枝頂端形成的綠色花球?yàn)楫a(chǎn)品，其營養(yǎng)豐富，色、香、味具佳，具有抗氧化、抗病毒、助消化和抗衰老等作用[1-5]，是國際市場(chǎng)十分暢銷的一種名特蔬菜。近年來，東亞地區(qū)己經(jīng)成為繼歐洲和北美之后的第三大酸雨區(qū)，且受影響面積有快速增加的趨勢(shì)，致使酸雨己經(jīng)成為中國最重要的環(huán)境問題之一[6]。已有大量研究結(jié)果表明，酸雨會(huì)破壞蔬菜的正常生長(zhǎng)發(fā)育，從而降低蔬菜產(chǎn)量[7-11]。

糖基轉(zhuǎn)移酶是一類普遍存在于動(dòng)物、植物、真菌等生物體內(nèi)能夠通過合成糖苷鍵將糖基連接到特定受體的酶[12]。目前此本科類可被分為90多個(gè)不同家族，其中，GT家族1的研究報(bào)道較多，該家族酶類的糖基化修飾在植物代謝過程中具有重要地位，多數(shù)情況下糖基化是植物合成皂苷、黃酮化合物、甾體生物堿、氰醇等次生代謝物質(zhì)的最后一步反應(yīng)[13-15]，而合成的次生代謝物質(zhì)對(duì)植物抵御和適應(yīng)環(huán)境的變化起著重要作用[16]。糖基化產(chǎn)物也是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的組分，可用于免疫反應(yīng)、細(xì)胞間信號(hào)傳遞和蛋白質(zhì)糖基化，這些生物學(xué)功能使糖基轉(zhuǎn)移酶日漸受到人們的重視[17]。β-1， 4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H（β-1，4-xylosyltransferase IRX9H）是糖基轉(zhuǎn)移酶家族GT家族1中的成員，以UDP-木糖（UDP-Xyl）作為專一性的糖供體[13]，而GT家族1中所含成員多與植物的次級(jí)代謝相關(guān)，可以推測(cè)β-1， 4-木糖基轉(zhuǎn)移酶可能參與了植物在逆境脅迫下的抗性機(jī)制。

迄今為止，國內(nèi)外從分子機(jī)制研究青花菜抗逆性的報(bào)道較少，僅蔣明等[3， 18]、彭禮瓊等[19]研究了霜霉病侵染下查爾酮合成酶、抗壞血酸過氧化物酶的作用機(jī)制。本研究從青花菜葉片中克隆得到β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)分析，以期探究其在酸雨脅迫下的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為卓越青花菜種子，由福建立信種苗有限公司提供。選取飽滿度一致的種子，浸種催芽后，點(diǎn)播于100穴的育苗盤內(nèi)，待植株長(zhǎng)至2片葉子、高約5 cm時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)良好、一致的青花菜植株，移栽于含有混合營養(yǎng)基質(zhì)的營養(yǎng)缽內(nèi)，培育青花菜。

1.2 方法

1.2.1 青花菜RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 待青花菜幼苗長(zhǎng)到4～5葉期，選取生長(zhǎng)良好的植株，取其葉片為材料。采用Trizol法提取青花菜葉片的總RNA，Trizol試劑由Invitrogen公司提供，其提取方法參考其說明書。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR合成3′端cDNA，其中需用引物AP代替試劑盒引物。采用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit 的試劑盒合成5′端cDNA。

1.2.2 β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的克隆

實(shí)驗(yàn)室利用cDNA-AFLP技術(shù)分析青花菜在模擬酸雨脅迫下表達(dá)譜的變化，獲得了與擬南芥β-1， 4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性較高的TDF差異片段，大小為236 bp。

3′RACE：以合成的3′端cDNA為模板，上游引物為B3-175和B3-111，下游引物為通用引物AUAP（表1），反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL、上游引物（10 μmol/μL）1μL、下游引物（10 μmol/μL）1 μL、2×MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，共25 μL的體系。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，引物退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。3′RACE采2輪反應(yīng)，第一輪反應(yīng)體系以B3-175和AUAP為引物，退火溫度為55.8 ℃，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物稀釋100倍作為第二輪擴(kuò)增模板，引物為B3-111和AUAP，退火溫度為53.2 ℃。對(duì)目的片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證與測(cè)序參照陳瓊娥[20]的方法。

5′RACE：以合成的5′端cDNA為模板，下游引物為B5-48和B5-195，上游引物為通用引物UPM和NUP（表1）。5′RACE采用兩輪反應(yīng)，第一輪反應(yīng)體系以B5-48和UPM為引物，退火溫度為58.9 ℃，延伸時(shí)間為1 min 20 s，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物稀釋100倍作為第二輪擴(kuò)增模板，引物為B5-195和NUP，退火溫度為52.4 ℃，延伸時(shí)間為1 min 20 s，其他的反應(yīng)體系和程序同3′RACE。對(duì)目的片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證與測(cè)序參照陳瓊娥[20]的方法。

利用DNAMAN 6.0軟件把克隆得到3′端片段、5′端片段和原來的差異片段序列進(jìn)行拼接。

1.2.3 開放閱讀框驗(yàn)證 通過NCBI網(wǎng)站的“ORF Finder”工具查找拼接后基因全長(zhǎng)的起始密碼子和終止密碼子，做上標(biāo)記，在其附近設(shè)計(jì)開放閱讀框的上下游引物B-F和B-R（表1）。退火溫度為57.4 ℃，延伸時(shí)間為1 min 20 s，其他的反應(yīng)體系和程序同3′RACE，擴(kuò)增后對(duì)目的片段進(jìn)行回收與測(cè)序。

1.2.4 β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用NCBI的“blastn”、“blastp”等工具對(duì)該基因進(jìn)行同源性分析，利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用Smart服務(wù)器分析保守域和功能位點(diǎn)，利用Protparam在線分析工具對(duì)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)推測(cè)分析，利用SignaIP 4.1工具對(duì)該基因的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，利用軟件MEGA5.2繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 模擬酸雨脅迫下的β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的表達(dá)分析 根據(jù)中國福建地區(qū)主要以SO42-為主的特點(diǎn)，用分析純H2SO4和NH4NO3配制成SO42-和NO3-的當(dāng)量比為4.19的模擬酸雨母液，母液pH值為1.0，取適量母液用蒸餾水稀釋，配置pH2.0的模擬酸雨，用pHS-2C酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH值。待青花菜幼苗長(zhǎng)至4～5葉期，選取生長(zhǎng)良好的青花菜，用配置好的pH2.0的模擬酸雨噴灑，葉片滴液時(shí)停止噴灑，每天處理1次，共處理9 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。分別取0、3、6、9 d的葉片提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用AP代替試劑盒引物。熒光定量PCR儀為BioRad icycler iQ，上游引物為B-FN，下游引物為B-RN（表1）。反應(yīng)體系和程序按照TaKaRa公司的SYBRR Premix Ex TaqTM（Tli RnaseH PIus）試劑盒的說明書，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 20 s；94 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)以18S為內(nèi)參基因，重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同時(shí)間IRX9H基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的克隆

通過3RACE擴(kuò)增，得到了358 bp左右的片段（圖1-A）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過blastn比對(duì)，與擬南芥β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移IRX9H的mRNA相似度為83%，說明3′RACE 獲得的片段與通過cDNA-AFLP技術(shù)獲得的差異片段屬于同一基因。

通過5′RACE擴(kuò)增，得到了1 186 bp左右的片段（圖1-B）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過blastn比對(duì)，與擬南芥β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移IRX9H的mRNA相似度為85%，說明5′RACE 獲得的片段與通過cDNA-AFLP技術(shù)獲得的部分差異片段屬于同一基因。

將TDF片段、3′RACE和5′RACE獲得的序列利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行拼接，得到一條1 550 bp的全長(zhǎng)cDNA序列，包含1個(gè)1 155 bp的ORF閱讀框，編碼的蛋白質(zhì)含有384個(gè)氨基酸（圖2）。由于該基因與擬南芥的β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性為91%，因此，該基因命名為青花菜β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因，GenBank登錄號(hào)為：KF715851。

2.2 開放閱讀框結(jié)果分析

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)開放閱讀框PCR產(chǎn)物，可得到1條1 100 bp左右的片段（圖1-C），對(duì)該條帶進(jìn)行回收與測(cè)序，所得的序列和編碼的氨基酸見圖2中1～1 155部分序列。

2.3 β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 6.0軟件將β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因編碼的氨基酸序列與其他植物進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥-UDP（Arabidopsis thaliana-UDP）、琴葉擬南芥（Arabidopsis lyrata）、芥菜（Capsella rubella）和擬南芥-IRX9H（thaliala-IRX9H）的相似性分別為88%、82%、82%和82%（圖3）。

琴葉擬南芥： Arabidopsis lyrata（GenBank： XP_002893477.1）； 芥菜： Capsella rubella（GenBank： EOA37898.1）； 擬南芥-IRX9H： Arabidopsis thaliala-IRX9H（GenBank： NP_973922.1）； 擬南芥-UDP： Arabidopsis thaliala-UDP（GenBank： AAM64331.1）。

由NCBI中“blastp”工具在線分析結(jié)果可知，該蛋白序列含有Beta1， 3-glucuronyltransferase I（GlcAT-I）的部分區(qū)域，位于氨基酸序列的140～350處具有“DXD”模體，這一區(qū)域參與蛋白多糖合成的初始步驟。

在Smart服務(wù)器分析保守域和功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列在23～50處有1個(gè)長(zhǎng)度為28個(gè)氨基酸的低復(fù)雜度區(qū)域，E-value值為116 000；在14～74處發(fā)現(xiàn)1個(gè)Cation_ATPase_N區(qū)域，E-value值為116 000，該保守N-末端區(qū)域發(fā)現(xiàn)植物機(jī)體借助于P型ATP酶進(jìn)行陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)，包括運(yùn)輸H+、Na+、Ca2+、Na+/K+、H+/K+等；在98～213處存在SEA保守域，E-value值為2 170，推測(cè)其具有調(diào)節(jié)或綁定碳水化合物側(cè)鏈的功能；在162～251處存在Bro-N 域，E-value值為99 400，這屬于一個(gè)家族，包括桿狀病毒BRO和ALI模體蛋白的N-末端，BRO蛋白的功能目前是未知的；在187～254處存在1個(gè)BLUF 域，E-value值為101 000， BLUF域已被證明與FAD結(jié)合在阿帕蛋白，阿帕蛋白參與光合作用系統(tǒng)的藍(lán)光響應(yīng)機(jī)制；在187～366處存在TIR域，E-value值為1 490，該域在昆蟲和哺乳動(dòng)物的抗真菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，同時(shí)含有該域的植物蛋白參與了宿主防御機(jī)制。

利用Protparam在線分析工具對(duì)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)推測(cè)分析，該蛋白包含384個(gè)氨基酸，分子量為43 897.8，等電點(diǎn)為9.08，判斷為堿性蛋白，分子式為C1964H3044N558O567S11，原子總數(shù)為6 144。不穩(wěn)定系數(shù)為63.46，說明該蛋白不穩(wěn)定。脂肪指數(shù)為75.86，親水性評(píng)估值為-0.484，為親水性蛋白。該蛋白由22種氨基酸組成，其中絲氨酸含量最高，為8.6%。帶負(fù)電氨基酸總和為44，帶正電氨基酸總和為50。

利用SignaIP 4.1工具對(duì)該基因的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。

利用MEGA 5.2軟件對(duì)基因編碼蛋白作進(jìn)化分析。將該基因序列編碼的氨基酸序列在NCBI上的blastp搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青花菜的β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H蛋白與黃瓜（Cucumis sativus）、 草莓（Fragaria vesca）、 葡萄（Vitis vinifera）、 大豆（Glycine max）、 鷹嘴豆（Cicer arietinum）、 番茄（Solanum lycopersicum）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物具有同源性。利用MEGA 5.2軟件通過Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建氨基酸序列的進(jìn)化樹（圖4），經(jīng)過1 000次Boot-strap計(jì)算，青花菜與擬南芥的的β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因聚類關(guān)系最近。從進(jìn)化樹上看，相同科的植物聚為一類，如大豆、鷹嘴豆2個(gè)豆科植物聚為一類，青花菜與擬南芥十字花科植物聚為一類，進(jìn)化聚類值為100。說明植物β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H蛋白在同一科屬之間具有很高的同源性，推測(cè)其在進(jìn)化上相當(dāng)保守。

2.4 模擬酸雨脅迫下的β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)青花菜在模擬酸雨脅迫不同時(shí)期β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明，在未脅迫時(shí)，該基因在青花菜中的表達(dá)量較低；脅迫3 d后，該基因表達(dá)量大幅度上升，比未脅迫時(shí)的對(duì)照增加了13倍；而后在脅迫6 d后，該基因表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，但其表達(dá)量仍高于對(duì)照，為對(duì)照的5.64倍；在脅迫9 d后，該基因的表達(dá)量低于對(duì)照，為對(duì)照的65%（圖5）。在模擬酸雨脅迫后，該基因表達(dá)量迅速上升，之后下降，推測(cè)該基因在青花菜的抗酸雨脅迫中發(fā)揮了調(diào)控作用。

3 討論與結(jié)論

植物在受到逆境脅迫時(shí)，可通過自身誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)物質(zhì)，起到一定的防御作用。植物糖基轉(zhuǎn)移酶是一類與糖脂、多糖、糖蛋白、核酸、植物次生產(chǎn)物等生物分子的代謝密切相關(guān)的酶[21-22]，廣泛存在于植物細(xì)胞中，主要通過產(chǎn)生糖苷鍵將供體糖分子或相關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特異的受體上[23]。糖基轉(zhuǎn)移酶作用有調(diào)節(jié)激素含量平衡、增加植物對(duì)逆性環(huán)境的抵抗能力、參與植物次級(jí)代謝調(diào)節(jié)、參與植物脫毒反應(yīng)、參與植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24-25]。對(duì)擬南芥基因組序列進(jìn)行搜索，可找到99個(gè)相關(guān)的可能的糖基轉(zhuǎn)移酶基因[26]，并已鑒定出這些酶所修飾的次級(jí)代謝產(chǎn)物有脫落酸、吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素等[27]。據(jù)此推測(cè)，植物受到逆境脅迫時(shí)，β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因會(huì)影響植物次級(jí)代謝物質(zhì)的生成、信號(hào)的傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)激素含量等，進(jìn)而提高自身的逆境生存能力。

基因的功能域?qū)τ诮沂净蛟谥参矬w內(nèi)的作用具有重要意義?？寺～@得β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因含有多個(gè)功能域：GlcAT-I部分區(qū)域，具有“DXD”模體，參與蛋白多糖合成的初始步驟，“DXD”模體是GT-A超家族的一個(gè)重要特征，對(duì)酶的催化活性起著不可或缺的作用，主要是通過二價(jià)金屬陽離子（Mn+）配位作用使“DXD”模體與NDP一糖供體的磷酸基相連[28]；Cation_ATPase_N區(qū)域，ATP酶催化ATP水解釋放能量，推動(dòng)質(zhì)子進(jìn)行跨膜運(yùn)輸；SEA域是一個(gè)與O-糖基化相關(guān)的保守域，存在于集聚蛋白、腸激酶、紫色球海膽精蛋白、基底膜蛋白多糖等多種結(jié)構(gòu)體內(nèi)，這些蛋白功能多樣，但共同點(diǎn)是都存在于糖基化的環(huán)境內(nèi)，這個(gè)保守域可能調(diào)節(jié)或協(xié)助相鄰的碳水化合物結(jié)合；BRO-N域功能目前是未知的；TIR域，定點(diǎn)突變和缺失分析結(jié)果表明，TIR結(jié)構(gòu)域是Toll和IL-1R活動(dòng)所必需的部分，已有研究揭示了與該域相關(guān)的三個(gè)高度保守的區(qū)域的功能，盒1（FDAFISY）、盒2（GYKLC-RD-PG）、盒3（一個(gè)被氨基酸殘基包圍的保守W域），其中盒1和盒2參與了結(jié)合蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)，而盒3主要涉及附近受體結(jié)合作用，這可能是通過與細(xì)胞骨架的相互作用而實(shí)現(xiàn)的，此外，該域還參與了植物的防御機(jī)制。從上述該基因序列各域的功能分析結(jié)果可知，該基因在植物體內(nèi)參與了多糖合成、能量代謝、碳水化合物的結(jié)合、光合作用系統(tǒng)的藍(lán)光響應(yīng)機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)、宿主防御機(jī)制，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，但具體的作用機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。

青花菜受模擬酸雨脅迫時(shí)，葉片最先表現(xiàn)出來。黃輝等[29]深入報(bào)道了酸雨對(duì)植物生理生態(tài)的影響機(jī)制：酸雨對(duì)植物的影響是先通過葉片的角質(zhì)層和氣孔破壞葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，酸雨中的H+置換葉片中的Mg2+，使得葉綠素的合成受阻，而葉綠素對(duì)光能的吸收、傳遞及光化學(xué)反應(yīng)具有重要影響，因次，抑制了葉片的光合作用；葉片的氣孔與植物的蒸騰作用和呼吸作用密切相關(guān)，酸雨破壞氣孔，造成氣孔關(guān)閉，進(jìn)而降低蒸騰速率和呼吸速率，抑制植物正常生長(zhǎng)；當(dāng)酸雨落到葉片上，會(huì)加速其中的的K、Ca、Mn、Zn和Mg等金屬元素淋溶，促進(jìn)N、A1及Cu的富集，這種影響導(dǎo)致植物體內(nèi)元素失衡，影響正常的物質(zhì)代謝和生理生化過程，降低植株的活力和抗性，最終使葉片褪綠變淡，最后變黃、枯死。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)青花菜β-1， 4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因在模擬酸雨脅迫不同時(shí)間的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，隨著酸雨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，青花菜β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在脅迫處理3 d后表達(dá)量最高，9 d后最低，并低于對(duì)照。這說明當(dāng)酸雨脅迫時(shí)，青花菜β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因被誘導(dǎo)，表達(dá)水平迅速增高。一段時(shí)間后，表達(dá)量又開始下降，其原因可能為：一是，隨著模擬酸雨危害程度的加深，誘導(dǎo)該基因的環(huán)境惡化，pH值降低，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，使得表達(dá)量降低；二是，該基因表達(dá)后誘導(dǎo)下游的抗性相關(guān)基因表達(dá)，使得青花菜對(duì)模擬酸雨脅迫產(chǎn)生適應(yīng)，不再誘導(dǎo)β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的表達(dá)[30]；三是，該基因誘導(dǎo)的下游表達(dá)基因大量表達(dá)后，對(duì)自身產(chǎn)生抑制作用，兩者存在拮抗關(guān)系，導(dǎo)致β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因表達(dá)量下降。

本研究從青花菜中克隆到了β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H基因的cDNA全長(zhǎng)，長(zhǎng)度為1 550 bp，開放閱讀框?yàn)? 155 bp，編碼384個(gè)氨基酸，經(jīng)同源性比對(duì)分析，該基因與擬南芥的β-1，4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性為91%，二者都含有“DXD”模體。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該序列編碼的氨基酸序列中含有GlcAT-I、Cation_ATPase_N區(qū)域、SEA保守域、Bro-N域、BLUF域、TIR域多個(gè)功能區(qū)域，分子式為C1964H3044N558O567S11，分子量為43 897.8，有1個(gè)跨膜螺旋區(qū)域，沒有信號(hào)肽。氨基酸序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，青花菜與擬南芥關(guān)系最為接近，處于同一分支上。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其在模擬酸雨脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析，推測(cè)其可能受逆境脅迫誘導(dǎo)，在植物的抗逆性反應(yīng)中起著非常重要的作用，此結(jié)果為下一步研究其在抗酸雨脅迫中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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