胡鵬程 陳光

摘要目前酶作為一種性能優(yōu)良的生物催化劑被廣泛應(yīng)用。由于酶在應(yīng)用過程中的缺點(diǎn)如穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用等，酶在工業(yè)化利用之前都要經(jīng)過處理來改善酶的性能，于是固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。通過模仿人體膜作用機(jī)理，使酶固定化，并且得到迅速的發(fā)展。主要闡述了醫(yī)藥學(xué)、化工、食品制造等方面固定化酶的應(yīng)用情況以及該技術(shù)的一些最新研究成果。

關(guān)鍵詞酶；固定化；改進(jìn)；應(yīng)用

中圖分類號S188+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號0517-6611（2014）14-04185-02

Advances in Studies of Enzyme Immobilization

HU Pengcheng et al（Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin 130118）

Abstract As a biocatalyst with excellent performance， enzyme is widely used. However， due to its disadvantages in the application process， such as poor stability and impossibility of repeated use， it must be treated before industrial production. In this situation， people developed immobilization technology. Through simulating the action mechanism of the human membrane， enzyme immobilization technology is developing rapidly. This paper mainly elaborated application of enzyme immobilization in medicine and pharmacology， chemical industry， and food manufacturing industry， and latest advances in studies.

Key words Enzyme； Immobilization； Improvement； Application

酶作為一種生物催化劑可以在常溫、常壓下參與體內(nèi)的各種代謝反應(yīng)，具有高選擇性、催化反應(yīng)條件溫和、無污染等特點(diǎn)，而且其數(shù)量和性質(zhì)不會(huì)改變。酶具有親水性，與疏水性底物沖突[1]；再者，通常的酶制劑是不可回收的，造成酶制劑成本昂貴；最后，受外界條件的影響，酶活性很不穩(wěn)定。為了解決上述問題，固定化酶技術(shù)被提了出來。在20世紀(jì)60年代，固定化酶技術(shù)得到發(fā)展，即用固體材料將酶限制在一定區(qū)域內(nèi)的技術(shù)[2-3]。固定化酶技術(shù)突破性地實(shí)現(xiàn)了酶的可回收利用，因而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[4]。同時(shí)，關(guān)于酶固定化方法的研究也取得許多重要成果。

1固定化酶簡介

美國科學(xué)家Nelson和Griffn于1916年最早發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象。我國的固定化酶研究開始于1970年。直到20世紀(jì)60年代，固定化技術(shù)才得到快速發(fā)展[5]。

固定化酶是一種酶工程的常見技術(shù)。酶將被吸附到一種惰性的低水溶性物質(zhì)上即在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)。與游離酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點(diǎn)：使酶在反應(yīng)中被固定，從而易于從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，在較長時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用；反應(yīng)過程易控制，有助于提高酶的穩(wěn)定性；由于酶易與底物和產(chǎn)物分開，產(chǎn)物增加。它在工業(yè)和醫(yī)藥等方面有著誘人的應(yīng)用前景。

2固定化方法

傳統(tǒng)的固定化方法有吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法[6]。這些方法在使用中不會(huì)輕易改變酶的空間構(gòu)相，所以可以較好地保存酶的活性，提高穩(wěn)定性。但是，傳統(tǒng)方法也有其自身難以避免的缺陷，故在酶的固定化技術(shù)使用范圍仍然十分有限。

吸附法是酶與載體表面之間以范德華力結(jié)合，往往較弱[7]，使得酶與載體結(jié)合不牢，易脫落[8]。通常，這種力有離子鍵、氫鍵、疏水作用。由于使用價(jià)格低廉，載體可重復(fù)使用，酶便于回收。這是酶固定化技術(shù)中最經(jīng)濟(jì)的方法。其缺點(diǎn)是可能會(huì)由于吸附劑引起酶變性。宋寶東等[9]對源于Candida rugosa的脂肪酶在吸附樹脂AB8載體上進(jìn)行了吸附固定，固定化后酶活損失約30%，但穩(wěn)定性提高約60%。

包埋法是高聚物和酶單體之間的聚合，即為了將酶固定化，使酶被包埋在聚合物中，從而實(shí)現(xiàn)酶的固定化的方法。酶活回收率較高[10]。該方法基本上沒改變酶的結(jié)構(gòu)，僅僅是將酶固定在聚合物形成的網(wǎng)格或微膠囊中。常用的包埋載體有海藻酸鈉、明膠等[11]。其缺點(diǎn)是對酶的體積有要求。這是因?yàn)槊阁w積太大，會(huì)被聚合物形成一定的空間阻礙，影響包埋的過程。有研究人員用丙烯酰胺聚合載體包埋，葡萄糖氧化酶[12]。Bomscheur等[13]利用水性表面活性膠粒用乳液包埋，將酶相分離出來。

共價(jià)結(jié)合法是一種較成熟的方法[14]，即以共價(jià)鍵將酶和載體結(jié)合，使酶得以固定的方法。相較于前2種方法，共價(jià)結(jié)合法研究得較早，所以比較成熟。共價(jià)結(jié)合法可以將酶以共價(jià)鍵的方式固定，十分牢固，所以更耐受高濃度底物，但是由于底物離子強(qiáng)度大，該方法對酶的要求也變得極其苛刻，否則極易造成酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。薛屏等[15]將青霉素?；敢怨矁r(jià)結(jié)合的方法固定在含鐵MCM41介孔分子篩表面，發(fā)現(xiàn)固定化酶表觀活性分別為782和256 U/g。

交聯(lián)法是酶分子和交聯(lián)劑形成共價(jià)鍵[16]將酶分子固定的方法。交聯(lián)劑通常是雙功能或多功能的試劑。由于交聯(lián)過程中氨基咪唑基等基團(tuán)極易參與反應(yīng)，單用戊二醛做交聯(lián)劑時(shí)極易造成酶失活。王慧玲等[17]以戊二醛為交聯(lián)劑，以海藻酸鈉為載體，固定脂肪酶，固定化酶活為22 895 U/g，酶活回收率為67.57%?？梢钥闯?，固定化酶的活化能力遠(yuǎn)高于游離狀態(tài)的酶。

由于每種固定方法都有一定的使用限制，往往一種酶可以有很多方法去固定，但是沒有一種像PCR普遍適用于基因工程那樣的技術(shù)，普遍適用于酶的固定化。目前，通常將這幾種方法結(jié)合，提高酶的活性和穩(wěn)定性[18-19]。

3固定化方法的改進(jìn)

通過現(xiàn)有的技術(shù)手段如聲、光、電的應(yīng)用可以得到很多新的產(chǎn)品。于是，這些方法也被廣泛應(yīng)用于酶固定化技術(shù)的改良中。目前，對于固定化技術(shù)的改進(jìn)大多集中于制備新型固定化酶、制備新型載體、改變微環(huán)境增強(qiáng)酶活性以及進(jìn)行化學(xué)修飾來增強(qiáng)反應(yīng)活性等。

范超等[22]利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方法制備了親水聚合物修飾的硅膠顆粒，作為固定化酶載體，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)牛血清白蛋白（BSA）為樣本，1 min即可完成酶解，肽段對BSA的氨基酸序列覆蓋率達(dá)90%以上。對于酵母菌全蛋白質(zhì)復(fù)雜樣本的酶解，3 min酶解產(chǎn)物超過同樣條件下溶液酶解12 h的鑒定結(jié)果。宋子風(fēng)等[23]制備了鱗片狀聚合物修飾的硅膠填料，并作為固定化酶載體，酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)后肽段的氨基酸序列覆蓋率達(dá)95%以上。

通常，表面活性劑可以使得酶的構(gòu)像發(fā)生改變，從而由于靜電結(jié)合導(dǎo)致活性中心始終處于暴露狀態(tài)。用酰基，可以使青霉素?；傅慕z氨酸活性中心裸露出來[24]。在水溶液中，酯酶的活性中心是處于封閉狀態(tài)的，將酯酶固定于疏水表面，就會(huì)使得酯酶的活性中心處于完全開放的狀態(tài)，從而保證酯酶的構(gòu)象始終處于有活性狀態(tài)[25]。

由于交聯(lián)酶結(jié)晶具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性，它被廣泛地應(yīng)用于無載體固定化方法中。采用這種方法固定，可以有效防止枯草桿菌蛋白酶[26-27]蛋白分解。

4固定化技術(shù)的應(yīng)用

4.1在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥品制備上的應(yīng)用隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)許多疾病與酶有密切關(guān)系[28]。酶進(jìn)入人體后，因其具有蛋白質(zhì)屬性而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。通常由于稀釋效應(yīng)，酶無法集中于靶器官組織，導(dǎo)致不能保持最合適的治療濃度，而固定化酶則很好地克服了游離酶的這些缺點(diǎn)。葡萄糖氧化酶被固定在納米微帶金電極上，可用于活體檢測[29]。

目前，在疾病診斷、治療等方面，酶正發(fā)揮著重要的作用。天冬酰胺酶可以用于白血病治療，但是在實(shí)際操作中酶的作用通常是被限制的。這是由于當(dāng)再次使用天冬酰胺時(shí)可能會(huì)引起免疫休克。為了消除這種抗原性，天冬酰胺酶的2個(gè)氨基可以用聚乙二醇修飾。吳梧桐等[30]對大腸桿菌L-天門冬酰胺酶Ⅱ進(jìn)行化學(xué)修飾，使得酶抗原性顯著減弱。陳吉祥等[31]將牛血Cu，ZnSOD用β環(huán)糊精修飾，抗炎活性增強(qiáng)，抗原性降低。

4.2在化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用酶在分析化學(xué)中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，如用于檢測癌癥病人排泄物中乳糖含量的乳糖酶試紙。酶電極的研究使用最早且至今仍很受關(guān)注。在化工上，聚丙烯酰胺原位固定化堿性蛋白酶水凝膠球體可直接應(yīng)用于洗滌劑的制備[32]。

4.3在食品工業(yè)的應(yīng)用食品行業(yè)很早就開始利用酶的固定化技術(shù)[33]。王靜等[34]以離子交換樹脂D151為載體，固定化乳糖酶處理牛乳，乳糖水解率提高。從黑曲霉發(fā)酵液中提取β葡萄糖苷酶酶液，并將其固定，可應(yīng)用于茶葉改良[35]。固定化的果膠酶可提高果汁的榨汁率[36]。

事實(shí)上，酶固定化技術(shù)的應(yīng)用遠(yuǎn)不止于此。不難看出，酶的固定化技術(shù)已經(jīng)與人們的生活息息相關(guān)，尤其是在食品工業(yè)方面較為普及。酶固定化技術(shù)正在以其優(yōu)良的特性，逐步改變著人們的生活。

5展望

酶是一種高效的生物催化劑，但是由于傳統(tǒng)的酶在水相中不穩(wěn)定，它在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中不利于推廣，故而產(chǎn)生了酶的固定化技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥品制備、化工和食品制造等領(lǐng)域。但是，傳統(tǒng)的固定化方法很難制備出性能優(yōu)異的酶。伴隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，很多新的技術(shù)被應(yīng)用于酶的固定化中，如更好地利用天然高分子材料，合成具有特定官能團(tuán)的高分子載體，使得酶與載體在溫和條件下共價(jià)偶聯(lián)；改變空間結(jié)構(gòu)是為了使酶可以突破因固定化而產(chǎn)生限制的常用的化學(xué)修飾方法；改變固定化酶所處的微環(huán)境，增強(qiáng)酶在局部空間內(nèi)的活力等?，F(xiàn)代酶固定化技術(shù)涉及生物、有機(jī)化學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科，而新的固定化方法改善了酶的穩(wěn)定性、催化活力、立體選擇性和回收等性能。不難看出，很多學(xué)者在為建立一種可以普遍推廣的固定化酶技術(shù)而努力。這也正是固定化酶技術(shù)發(fā)展的一個(gè)目標(biāo)。一種酶往往可以用很多技術(shù)來固定，但是一種技術(shù)卻很難適用于所有的酶，所以如同PCR技術(shù)的出現(xiàn)改變了分子生物學(xué)領(lǐng)域一樣，如果固定化酶技術(shù)也能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)固定化，那么不亞于一次新的工業(yè)革命。

參考文獻(xiàn)

[1] 喬德亮，胡冰，曾曉雄.酶固定化及其在食品工業(yè)中應(yīng)用新進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2008（1）：304-307.

[2] BUCHHOLZ K，KASCHE V.Biokatalysatoren und enzymtechnologie[J].VCH，1997，18（1）：7-11.

[3] CHIBATA I.Immobilized Enzymes[M].New York，London，Sydney，Toroqo：John Wiloy and Sons，1978.

[4] KATCHALSKIKATZIR E.Immobilized enzymeslearning from past successes and failures[J].Trends Biotechnol，1993，11（11）：471-478.

[5] 禹邦超，文德立.應(yīng)用酶學(xué)導(dǎo)論[M].武漢：華中師范大學(xué)出版社，1994.

[6] 陳石根，周潤琦.酶學(xué)[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2001：8-20.

[7] IVANOV A E，SCHNEIDER M P.Methods for the immobilization of lipases and their use for ester sybthesis[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，1997，3（6）：303-309.

[8] 賈鵬翔，劉雪瑩.固定化酶及其在化工等領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].皮革科學(xué)與工程，2004，14（5）：31-37.

[9] 宋寶東，宋麗，龐春霞，等.樹脂吸附法固定 Candida rugosa 脂肪酶[J].化學(xué)工程，2009，37（4）：8-10.

[10] 張磊，侯紅萍.固定化細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（2）：17-18.

[11] 肖美艷，徐爾尼，陳志文.包埋法固定化細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2003，24（4）：158-161.

[12] 王洪祚，劉世勇.酶和細(xì)胞的固定化[J].化學(xué)通報(bào)，1997（2）：22-26.

[13] BOMSCHEUR UWE.Padmanabhan，padmini[J].Microspheres，Microcapsules Liposomes，1999，1：543-560.

[14] 羅九甫.酶和酶學(xué)工程[M].上海：上海交通大學(xué)出版社，1996.

[15] 薛屏，盧冠忠，郭楊龍，等.青霉素?；冈诤FMCM41介孔分子篩上的固定化研究[J].化學(xué)通報(bào)，2003，66（10）：681-683.

[16] 李勤.固定化技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用和發(fā)展研究[J].四川食品與發(fā)酵，2006，42（4）：16-19.

[17] 王慧玲，趙燕，李建科.戊二醛交聯(lián)法固定擴(kuò)展青霉脂肪酶的研究[J].食品科技，2012（6）：27-31.

[18] 孫玉英，張繼泉.吸附交聯(lián)法和包埋法固定化混合酶研究[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，22（3）：82-88.

[19] 周彥波，張汝壯，魯軍.樹脂吸附-交聯(lián)法固定化脂肪酶的研究[J/OL].http：//www.doc88.com/p-115697659497.html.

[20] 黎剛.固定化技術(shù)進(jìn)展[J].中國生物工程雜志，2002（5）：45-48.

[21] MERIDOR D，GEDANKEN A.Preparation of enzyme nanoparticles and studying the catalytic activity of the immobilized nanoparticles on polyethylene films[J].Ultrasonics Sonochemistry，2013，20（1）：425-431.

[22] 范超，宋子鳳，秦偉捷，等.新型親水聚合物修飾硅膠顆粒固定化酶的制備及在蛋白質(zhì)組鑒定中的應(yīng)用[J].色譜，2013，31（5）：423-428.

[23] 宋子鳳，張慶林，張養(yǎng)軍，等.新型鱗片狀聚合物修飾硅膠填料固定化酶的制備及其在蛋白質(zhì)組鑒定中的應(yīng)用[J].色譜，2012，30（6）：549-554.

[24] MCVEY C E，WALSH M A，DODSON G G，et al.Crystal structures of penicillin acylase enzymesubstrate complexes：structural insights into the catalytic mechanism[J].J Mol Biol，2001，313：139-150.

[25] FEMANDEZ L R，ARMISEN P，SABUQUILLO P，et al.Immobilization of lipases by selective adsorption on hydrophobic supports[J].Chem Phys Lipids，1998，93：185-197.

[26] YIFONG W，KIRILL YAKOVLEVSKY，BAILING Z，et al.Crosslinked crystals of subtilisin：versatile catalyst for organic synthesis[J].J Org Chem，1997，62：3488-3495.

[27] VAN UNEN D J，ENGBERSEN J F，REINHOUDT D N.Why do crown ethers activate enzymes in organic solvents[J].Biotechnol Bioeng，2002，77（3）：248-255.

[28] 王智，茍小軍，曹淑桂.脂肪酶在生物化工中的應(yīng)用[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，22（1）：1-8.

[29] SHOEMAKER S G，HOFFMAN A S，PRIEST J H.Synthesis and properties of vinyl monomer/enzyme conjugates.Conjugation of Lasparaginase with Nsuccinimidyl acrylate[J].Biochem Biotechno，1987，15（1）：11-24.

[30] ELAH H K，吳梧桐，周景晶，等.右旋糖苷對大腸桿菌L天門冬酰胺酶Ⅱ的化學(xué)修飾[J].藥物生物技術(shù)，1997，4（4）：208-211.

[31] 陳吉祥，袁勤生.β環(huán)糊精對SOD的化學(xué)修飾[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1998，29（2）：59-61.

[32] LOZANO P，AVELLANEDA A A，IBORRA J L.Peptide synthesis by papain in alkali halide media[J].Biocatal Biotransform，1996，13（4）：255-269.

[33] BERGMEYER H U.Methods of Enzymatic Analysis[M].New York：Academic Press，1985.

[34] 王 靜，賈英民，鄒磊，等.固定化酶生產(chǎn)低乳糖牛乳的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（8）：791-795.

[35] 李煒煒，陸啟玉.酶工程在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].糧油食品科技，2008，16（3）：34-37.

[36] 潘裕添，林進(jìn)妹，黃家福，等.蔬菜濃縮汁防褐變及后混濁工藝的研究[J].漳州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007（4）：83-88.