朱慧

【摘要】 目的 探討螺內(nèi)酯對大鼠心肌缺血再灌注損傷時細胞凋亡的影響。方法 選擇30只健康SD大鼠，采用結(jié)扎冠MI/RI）前降支后再通的方法=10心肌缺血再灌注的動物模型，隨機分為3組：假手術(shù)組（n=10）、缺血再灌注（MI/RI）組（n=l0）和藥物組（n=10）。光鏡及電鏡觀察標本病理形態(tài)改變，檢測各組再灌注3h后心肌局部凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Fas的表達，比較各組間差異。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，MI/RI組中Fas含量升高（P<0.01），Bcl-2含量明顯減少（P<0.05）；藥物組較MURI組Fas含量明顯降低（P<0.05），Bcl-2含量明顯增加（P

【關(guān)鍵詞】 缺血再灌注損傷；螺內(nèi)酯；細胞凋亡；大鼠

文章編號：1004-7484（2014）-02-0658-02

生理狀態(tài)下心肌內(nèi)存在一定量的氧自由基（oxygen free radic，OFR），組織細胞發(fā)生缺血缺氧時氧自由基清除功能下降，生成活性增強[1]；組織恢復血液和氧供時，又可產(chǎn)生大量的氧自由基，以各種方式造成細胞的急慢性損傷[2]，使缺血性損傷進一步加重。多年來，醫(yī)學界一直在探索有效的觖血心肌約再灌注療法，通過恢復缺血心肌的血液供應來挽救急性缺血的心肌組織，是目前治療急性心肌缺血及心肌梗死的主要措施：但是再灌注療法卻存在缺血再灌注損傷（MI/RI）等問題。由于心肌組織上存在大量醛固酮產(chǎn)物和鹽皮質(zhì)激素受體，因此本實驗運用醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯提前干預，探討螺內(nèi)酯是否具有減輕MI/RI時心肌細胞凋亡程度和改善心功能的作用。

1 資料與方法

1.1 材料與分組

1.1.1 藥品和試劑螺內(nèi)酯（某制藥廠），F(xiàn)as和Bcl-21免疫組化試劑盒（購自某生物有限公司）。

1.1.2 實驗動物及分組采用隨機平行對照的研究方法，選用清潔級SD大鼠30只（由某大學醫(yī)學院動物中心提供），雌雄不限，質(zhì)量200-2509，適應性飼養(yǎng)7d后用于實驗。隨機分為3組，假手術(shù)組（SHAM，n=10）、單純?nèi)毖俟嘧⒔M（MI/RI.n=10）和螺內(nèi)酯干預缺血再灌注組（SPI，凡：10）。SPI組于術(shù)前l(fā)周開始灌胃喂飼螺內(nèi)酯[5mg/（kg*d），bid]，所有實驗鼠術(shù)前禁食，自由飲水，以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。心肌MI/RI模型參照Simpsond的方法加以改進，開胸暴露心臟，于冠脈左前降支中1/2處穿線壞繞，結(jié)扎線向外收緊，通過肉眼觀察心肌顏色判斷結(jié)扎是否成功.45min后放松結(jié)扎線使冠狀動脈再通形成再灌注。其中假手術(shù)組絲線穿過冠狀動脈左室支但不結(jié)扎，所有實驗動物冠狀動脈再通形成后再灌注3h，后靜脈注入硫噴妥鈉致死動物，離斷大血管，取出心臟用冰生理鹽水迅速沖去心臟表面血液，剪除右心室及室間隔，選取MI/RI區(qū)標本切成4mm×4咖x6mm數(shù)塊，浸入4%福爾馬林固定液準備行光鏡和免疫組f{=檢測.另取Imm×lmm×2mm標本放人3%戊二醛固定液放人4℃冰箱中冷藏以備電鏡檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 凋亡相關(guān)基因蛋白的檢測再灌注3h結(jié)束后分離左心室心肌，取缺血區(qū)心肌組織，用100g/L甲醛液固定24h.常規(guī)脫水，石蠟包埋組織連續(xù)切片。以免疫組化SP法觀察心肌細胞Fas、Bcl-2的表達情況。HPIAS21000圖像分析系統(tǒng)計算4值，作為測量Fas.Bcl-2蛋白表達的半定量參數(shù)。

1.2.2 電鏡檢測取樣品組織置入3%戊二醛內(nèi)預固定.0.1mmo/L磷酸緩沖液洗3遍。10g/L四氧化鋨酸后固定，雙蒸水沖洗，逐級丙酮酸脫水，環(huán)氧樹脂包埋.半薄切片，光鏡觀察定

位，超薄切片，醋酸油、檸檬酸鉛雙染，H-600透射電鏡觀察1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以χ±s表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物存活評價共計建立大鼠模型30只，術(shù)中及術(shù)后死亡3只，假手術(shù)組10只全部存活，缺血再灌注組存活8只，死亡2只，藥物組存活9只，死亡1只。假手術(shù)組大鼠心臟肉眼觀形態(tài)飽滿，呈暗紅色；MURI組大鼠心臟肉眼觀梗死MURI變薄，形態(tài)僵硬，塌陷，呈乳白色；藥物組整體觀形態(tài)與MI/RI組無顯著差異，顏色略深呈灰白色。

2.2 Fas和Bcl-2蛋白含量變化（A值）免疫組織化學染色后，Bcl-2和Fas蛋白陽性染色的細胞，其胞漿呈棕黃色。假手術(shù)組可見輕度的Bcl-2和Fas蛋白染色弱陽性，MI/RI組與假手術(shù)組比較bcl-2表達明顯下降，F(xiàn)as表達上調(diào)。藥物組與MVRI組比較，螺內(nèi)酯能明顯減低這一現(xiàn)象。

MI/RI組Fas含量（0.26±0.13）明顯高于假手術(shù)組（0.12±0.04）（P<0.01），藥物組Fas含量（0.15土0.03）明顯低于MI/RI組（0.25+0.12）（P<0.05）；MI/RI組Bcl-2含量（0.11±0.05）明顯

低于假手術(shù)組（0.21+0.04）（P<0.01），藥物組Bcj-2含量（0.19±0.03）明顯高于MI/RI組（0.10±0.05）（P<0.01）。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的確切機制尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn).I/R可能與鈣超載和氧自由基所致?lián)p傷有關(guān)。

缺氧尤其是再灌注期間激活Na+-H+交換，導致細胞內(nèi)Na+濃度增高，增加了Na+-Ca+交換機會，Ca+集聚于細胞內(nèi)，Ca+增高超載有可能啟動胞凋亡。Na+-H+交換阻斷劑HOE642及Ca+拮抗劉可抻剖因鈣超載導致的細胞凋亡，從而減輕I/R傷、縮小心肌梗死面積[1]。氧化還原反應是機體最廣泛和最重要的反應，在缺血再灌注時可產(chǎn)生大量的活性氧自由基，它們與蛋白質(zhì)，DNA和脂質(zhì)等反應引起蛋白質(zhì)氧化、DNA斷裂、胞膜出泡等綢囊胃亡的典型特征變化，一些抗氧化物質(zhì)及清除自由基的藥物可減輕這一反應。

醛固酮能誘導蛋白質(zhì)合成，促進細胞增殖。研究表明，醛固酮進入細胞后，僅與細胞質(zhì)受體結(jié)合，形成激素一受體復合物，獲得進入核內(nèi)的能力，再與受體結(jié)合，誘導蛋白質(zhì)合成，促進細胞增殖；醛固酮也可以直接增加核Ca2+及蛋白激酶C的含量，核Ca2+的增加能激活蛋白激酶C，蛋白激酶C可以導致核P53磷酸化與醛固酮受體結(jié)合，影響心肌細胞凋亡[4-5]。螺內(nèi)酯在受體水平上阻斷醛固酮的生物，阻斷醛固酮與P53的結(jié)合，抑制P53的激活，阻斷了P53對Bax及Bcl-2的調(diào)節(jié)作用，使Bcl-2下降。

螺內(nèi)酯抑制I/R時，心肌細胞凋亡的途徑可能是通過阻斷醛固酮與心肌細胞膜上受體結(jié)合，因為二者結(jié)合激活位于心肌細胞膜上的磷脂酶C，磷脂酶C使胞漿內(nèi)Ca2+濃度迅速升高激活蛋白激酶C，蛋白激酶C激活鈣調(diào)磷酸酶，鈣調(diào)磷酸酶影響前凋亡蛋白Bax，它能夠作用于線粒體使線粒體膜電位降低甚至于跨膜電位消失，同時伴有線粒體膜通透性升高，釋放細胞色素C，細胞色素C與凋亡蛋白激活因子及半胱氨酸蛋白酶形成復合物，激活半胱氨酸蛋白酶-3導致細胞凋亡[6]。

本實驗中我們觀察到大鼠缺血再灌注前給予螺內(nèi)酯可以使心肌細胞Fas蛋白表達減弱，Bcl-2蛋白表達增強，表明螺內(nèi)酯能抑制I/R過程中細胞凋亡的發(fā)生。通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Fas表達來抑制心肌細胞凋亡，可能是螺內(nèi)酯保護I/R心肌損傷的重要機制。螺內(nèi)酯作為一種醛固酮拮抗劑，具有自由基清除和抑制脂質(zhì)過氧化的作用[7]，螺內(nèi)酯下調(diào)細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，部分逆轉(zhuǎn)左心室肥厚[6]。

我們研究發(fā)現(xiàn)，缺血45min再灌注3h后，螺內(nèi)酯降低I/R時心肌細胞凋亡程度，從免疫組化結(jié)果分析，SPI組心肌細胞中Bax表達比I/R組明顯減少，而Bcl-2表達又較I/R組多，細胞凋亡亦較I/R組少。提示螺內(nèi)酯對UR心的影響有可能是通過抑制激活蛋白激酶C途徑抑制心肌細胞凋亡，從而改善急性損傷導致的心功能的下降。這一結(jié)果支持Harada等的有關(guān)螺內(nèi)酯對心肌缺血再灌注損傷有明顯的保護作用和具有抗心肌細胞凋亡作用的報道。

參考文獻

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