岳愛(ài)琴等

摘要[目的]對(duì)大豆異黃酮提取純化的最佳工藝條件及其抗氧化活性進(jìn)行研究。[方法]通過(guò)單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)， 確定提取大豆異黃酮的最佳工藝條件，應(yīng)用D101大孔樹(shù)脂技術(shù)對(duì)提取液進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，得出最佳純化條件，并對(duì)純化得到的染料木苷和大豆苷進(jìn)行抗氧化活性研究。[結(jié)果] 試驗(yàn)得出，提取大豆異黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度70%，料液比1∶15 g/ml，提取時(shí)間為3 h，提取溫度為60 ℃，最高得率達(dá)9.18%；純化最佳條件為：上柱靜態(tài)吸附時(shí)間5 h，洗脫時(shí)間30 min，80%乙醇作為洗脫劑，洗脫流速為l ml/min，并分離純化得到染料木苷和大豆苷；抗氧化活性研究表明，染料木苷、大豆苷和大豆總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基均具有清除作用。[結(jié)論] 研究對(duì)大豆保健食品開(kāi)發(fā)和天然藥物研制具有重要意義。

關(guān)鍵詞大豆異黃酮；提??；純化；抗氧化性

中圖分類號(hào)S565.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2014）28-09912-04

Extraction， Purification Technology and Antioxidation Activities of Soybean Isoflavones

YUE Aiqin1， SHI Shaojing2， XU Haijun2 et al （1. College of Agriculture， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801； 2. College of Arts and Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract [Objective] To study the optimum technique conditions and antioxidation activities of extraction and purification of soybean isoflavones. [Method] On the basis of single element experiments and L9（34） orthogonal experiments， the optimum technique conditions for extraction of soybean isoflavone were determined. D101 macroporous resin technology was applied to further purify the liquids. [Result] The optimum extraction conditions were obtained： ethanol concentration 70%， soybean to solvent ratio 1∶15 g/ml， extraction time 3 h， temperature 60 ℃. The extraction yield could be up to 9.18%. Purification process of soy isoflavones in soybean by using D101 macroporous resin， the optimum purification conditions were obtained： absorption time 5 h， elution time 30 min， ethanol concentration 80%， elution speed l ml/min， and obtain high purity of daidzin， genistin monomer. The antioxidation activity was analyzed， and the conclusion revealed that soybean isoflavones possessed superoxide radical and hydroxyl radical scavenging activities.[Conclusion] The study has significance on development of soybean health food and natural medicine.

Key words Soybean isoflavone； Extraction； Purification； Antioxidation activities

大豆異黃酮 （soybean isoflavone）是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的主要次生代謝產(chǎn)物之一，具有防治癌癥、預(yù)防心血管疾病、改善骨質(zhì)疏松、降低血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化和改善婦女更年期綜合癥等多種生理功能[1-3]。近年來(lái)，大豆異黃酮已被開(kāi)發(fā)成多種保健功能產(chǎn)品。20世紀(jì)90年代以來(lái)，對(duì)大豆異黃酮的提取工藝研究有不少報(bào)道[ 4-10]，由于大豆中異黃酮的含量較低，提取成本較高且提取工藝復(fù)雜，因此高效提取純化仍是目前提取工藝的一個(gè)關(guān)鍵性的問(wèn)題。為高效利用大豆種子中的大豆異黃酮，筆者對(duì)大豆異黃酮的提取、分離和純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并且分別檢測(cè)了染料木苷、大豆苷和大豆總黃酮的抗氧化作用，對(duì)大豆保健食品開(kāi)發(fā)和天然藥物研制具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料供試大豆種子晉大70，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆育種課題組提供；所用試劑均為分析純。主要儀器： 紫外分光光度計(jì)，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高速臺(tái)式離心機(jī)，Brucker600型核磁共振儀。

1.2方法

1.2.1影響大豆異黃酮提取率的單因素試驗(yàn)。

選取溫度、時(shí)間、乙醇濃度和提取液料比的不同水平，考察單因素對(duì)大豆異黃酮提取率的影響。

1.2.2大豆異黃酮提取工藝的優(yōu)化試驗(yàn)。

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以確定最佳提取工藝條件。

1.2.3D101大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線[11]。

在具塞三角瓶中裝入預(yù)處理過(guò)的D101大孔樹(shù)脂，向其中加入過(guò)量的經(jīng)初步純化后的樣品液，在室溫下振蕩，每隔1 h取一次樣，測(cè)定其中大豆異黃酮的含量。以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，樣品液中大豆異黃酮的濃度為縱坐標(biāo)，繪制D101樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。再加入70%乙醇在室溫下振搖進(jìn)行解吸，每隔15 min取一次樣，測(cè)定溶液中大豆異黃酮的含量，以解析時(shí)間為橫坐標(biāo)，樣品液中大豆異黃酮的濃度為縱坐標(biāo)，繪制D101樹(shù)脂的靜態(tài)解析動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.4D101大孔樹(shù)脂最佳吸附濃度的測(cè)定。

將濃度分別為1.0、0.7、0.4 mg/ml的大豆異黃酮提取液，以2.0 ml/min的流速通過(guò)層析柱，通過(guò)檢測(cè)收集液中大豆異黃酮的濃度，分析樣液濃度與樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的關(guān)系。

1.2.5D101大孔樹(shù)脂最佳洗脫流速的測(cè)定。

將濃度為1.0 mg/ml的大豆異黃酮提取液，分別以1.0、2.0、3.0 ml/min的流速通過(guò)樹(shù)脂柱，通過(guò)檢測(cè)收集液中大豆異黃酮的濃度，分析樣液濃度與樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的關(guān)系。

1.2.6大豆異黃酮對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力測(cè)定。采用連苯三酚氧化法[12]測(cè)定。

1.2.7大豆異黃酮對(duì)羥自由基（·OH）的清除能力測(cè)定。采用α脫氧核糖氧化法[13]測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1大豆異黃酮提取工藝單因素條件的研究

2.1.1溫度對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響。由圖1可以看出，提取溫度低于60 ℃時(shí)大豆異黃酮的提取量隨著溫度上升而顯著提高，高于60 ℃提取量增加趨勢(shì)變緩。由于溫度過(guò)高可能會(huì)對(duì)大豆異黃酮活性產(chǎn)生影響，因此，60 ℃為大豆異黃酮最佳提取溫度。

圖1溫度對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響

2.1.2浸提時(shí)間對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響。由圖2可以看出，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆異黃酮提取量增加，但提取時(shí)間超過(guò)2.5 h，大豆異黃酮得率的增加幅度變小。因此，提取大豆異黃酮的最佳浸提時(shí)間為2.5 h。

圖2時(shí)間對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響

2.1.3乙醇濃度對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響。從圖3可以看出，隨乙醇濃度的升高，大豆異黃酮的提取量逐漸增高，在乙醇濃度為70%時(shí)大豆異黃酮浸提量達(dá)到最大值，超過(guò)70%又開(kāi)始下降，所以70%乙醇提取效果較好。

圖3乙醇濃度對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響

2.1.4料液比對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響。如圖4所示，大豆異黃酮提取量隨料液比中溶劑的增大而增大。當(dāng)料液比小于1∶12 g/ml時(shí)異黃酮的提取量增加不明顯，如果繼續(xù)增加料液比中溶劑，成本會(huì)提高。因此，大豆異黃酮提取以料液比1∶12 g/ml為較好。

圖4料液比對(duì)大豆異黃酮提取的影響

2.2大豆異黃酮最佳提取工藝條件的正交試驗(yàn)

為了綜合考察溫度、時(shí)間、乙醇濃度、料液比4個(gè)因素相應(yīng)水平對(duì)大豆異黃酮浸提量的影響，以尋求最佳提取工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)來(lái)確定大豆異黃酮提取的最優(yōu)參數(shù)，水平值的設(shè)定是通過(guò)充分綜合考慮試驗(yàn)條件及試驗(yàn)結(jié)果的影響程度進(jìn)行選取，考查指標(biāo)為異黃酮含量（表1、2）。

從表2可以得到， 4個(gè)因素對(duì)大豆異黃酮浸提量影響的順序依次為：料液比（D）>萃取溫度（C）>乙醇濃度（A）>萃取時(shí)間（B）。料液比對(duì)異黃酮的浸提率的影響最為顯著，提取液越多提取效率越高；浸提劑濃度對(duì)浸提率的影響也較大，70%乙醇液與染料木苷的極性相似；異黃酮在溫度為60 ℃時(shí)浸提率提高，這與染料木黃酮在較高溫度下易溶解的性質(zhì)相符合。浸提時(shí)間對(duì)浸提率的影響不大。以異黃酮提取率為指標(biāo)得到的最優(yōu)組合為：乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為3 h，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶15 g/ml。為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)最佳組合的正確性，采用最優(yōu)組合條件分別進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為：大豆異黃酮最高含量為18.93 mg/g，最高得率為9.18%。

2.3D101大孔樹(shù)脂分離純化工藝的優(yōu)化

2.3.1D101大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。 從圖5可以看出，在初始階段，曲線急速上升，這表明D101大孔樹(shù)脂對(duì)異黃酮的吸附速度快，且單位時(shí)間內(nèi)對(duì)異黃酮的吸附量大。2 h時(shí)吸附速度逐漸減慢，5 h后曲線開(kāi)始趨于平緩，這說(shuō)明當(dāng)單位質(zhì)量樹(shù)脂吸附量達(dá)到一定程度時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附速度和吸附量增加迅速減少，考慮到工業(yè)化生產(chǎn)效率、產(chǎn)品得率等因素，該試驗(yàn)選擇5 h為上柱靜態(tài)吸附時(shí)間，此時(shí)大孔樹(shù)脂的吸附量已達(dá)到飽和吸附量的91.3%。

從圖6可以看出，D101大孔樹(shù)脂的靜態(tài)解析解析速度很快，并且解析率也很高，15 min解析率達(dá)到63%，30 min已達(dá)到93.5%。因此選擇30 min為洗脫時(shí)間。

圖5室溫條件下D101大孔樹(shù)脂吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖6大豆異黃酮的靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線

2.3.2D101大孔樹(shù)脂洗脫劑濃度的確定。 從圖7可以看出，樹(shù)脂的解析率隨著乙醇濃度的升高而增大，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，樹(shù)脂的解析率達(dá)到最大，乙醇濃度繼續(xù)增大，大孔樹(shù)脂的解析率變化不明顯。因此，選擇80%乙醇作為洗脫劑。

圖7乙醇濃度與樹(shù)脂解析率的關(guān)系

2.3.3D101大孔樹(shù)脂最佳吸附濃度和洗脫流速的研究。由圖8可看出，上柱液濃度分別為2.0、1.0、0.5 mg/ml時(shí)，對(duì)應(yīng)樹(shù)脂的穿透體積分別為20、25、30 ml。這表明隨著上樣液濃度的增加，樹(shù)脂的穿透體積隨上樣液濃度的增加而下降，泄漏點(diǎn)則隨之提前，因此可以得出起始濃度越高，吸附量越大。但是，較高的樣液濃度會(huì)造成樹(shù)脂的內(nèi)部孔道阻塞，吸附性能降低。該試驗(yàn)中所選的3種樣液濃度的穿透體積基本相似，而濃度較高時(shí)樹(shù)脂的工作吸附量相對(duì)較大。因此，選擇上柱液濃度為2.0 mg/ml。

由圖9可以看出，當(dāng)流速分別為1、2和3 ml/min時(shí)，大孔樹(shù)脂的穿透體積分別為30、25、15 ml。這表明大孔樹(shù)脂的工作吸附量隨著洗脫流速的加大而減小，泄漏點(diǎn)隨之提前，因此吸附效果以1 ml/min最好。TLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10、11。

2.4大豆異黃酮對(duì)O2-·和·OH的清除能力

結(jié)果表明，染料木苷、大豆苷和總黃酮均對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）具有清除作用。隨著時(shí)間的增加，各種異黃酮清除O2-·能力不斷增強(qiáng)（圖12）。

圖12大豆異黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

從圖13可以看出，大豆異黃酮、染料木苷和大豆苷對(duì)羥

自由基（·OH）有一定的清除作用，且隨著大豆異黃酮濃度

圖13大豆異黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

的增大，其對(duì)羥自由基的清除能力也隨之提高。

3結(jié)論與討論

單因素浸提試驗(yàn)分析表明，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)提取效率有一定的影響。提取率隨著料液比中溶劑的增大而提高。在低于70%濃度的乙醇范圍內(nèi)，提取效果隨著乙醇濃度的增大而提高，高于70%濃度的乙醇對(duì)其不利，其原因可能是大豆異黃酮中丙二?；蠖管蘸捅；玖夏拒蘸斜峄鶊F(tuán)，丙二酸基團(tuán)水溶性較其糖苷形式更強(qiáng)，因而更易溶于低濃度的乙醇溶液，而大豆苷和染料木苷則更易溶于高濃度的乙醇溶液。

應(yīng)用D101大孔樹(shù)脂技術(shù)對(duì)提取液進(jìn)行分離純化，純化最佳條件為：上柱靜態(tài)吸附時(shí)間5 h，洗脫時(shí)間30 min，80%乙醇作為洗脫劑，洗脫流速為l ml/min，并且分離純化得到染料木苷和大豆苷單體。

抗氧化活性研究表明，染料木苷、大豆苷和大豆總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基均具有清除作用。

參考文獻(xiàn)

[1]

劉穎，張牧，王小雪，等.染料木黃酮對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，23（1）：62-65.

[2] 徐霞，貢沁燕，魯映青，等.大豆異黃酮對(duì)去卵巢大鼠骨密度和雌激素活性的影響[J].中國(guó)新藥與臨床雜志， 2002，21（6）：321-325.

[3] MEZEI O，BANZ W J，STEGER R W，et al.Soy isoflavones exert antidiabetic and hypolipidemic effects through the PPAR pathways in obese zucker rats and murine RAW 264.7 cells[J].The Journal of Nutrition，2003，133（5）： 1238-1243.

[4] 袁建，鞠興榮.大豆異黃酮分離與精制工藝研究[J].食品科學(xué)，2002，23（8）：118-121.

[5] 孫玲，魏振承，徐志宏，等.大豆異黃酮提取純化及其抗衰老作用初探[J].食品科學(xué)，2002，23（8）：267-270.

[6] 胡衛(wèi)新，王曉磊，張潔，等.大豆異黃酮提取條件和大豆蛋白質(zhì)分離工藝研究[J].大豆科學(xué)，2005，24（1）：26-29.

[7] 張福麗，葛紅蓮，李婷，等.大豆渣中異黃酮的提取及抑菌活性[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2012，29（2）：1176-1181.

[8] 康新莉，田蒙蒙，閆麗萍，等.大豆異黃酮的純化工藝研究[J].應(yīng)用化工，2013，42（11）：2015-2017.

[9] 李華，趙振貴，李丹，等.大孔樹(shù)脂對(duì)大豆異黃酮的吸附性能研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（2）：19-22.

[10] 孫婕，蘇晶瑩，尹國(guó)友，等.D101大孔樹(shù)脂吸附大豆乳清廢液中異黃酮的實(shí)驗(yàn)研究[J].食品科技，2014，39（3）： 202-206.

[11] 蘆春明，邸錚.大孔吸附樹(shù)脂吸附大豆異黃酮的特性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（l）：92-95.

[12] 井樂(lè)剛，路芳，張永忠，等.大豆異黃酮的抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（2）：62-65.

[13] 趙新淮.茶葉提取物對(duì)自由基的清除能力[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，29（3）：284-288.