汪運舟 劉賢勇 索 勛

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

兔艾美耳球蟲(Rabbit coccidia)，是一類專性寄生于兔消化系統(tǒng)并引起嚴重疾病的寄生原蟲。兔球蟲共包含11個蟲種，以其寄生位點的不同，分為肝球蟲和腸球蟲兩類：前者指寄生于膽管上皮細胞的斯氏艾美耳球蟲，而后者包括寄生于腸道上皮細胞的腸艾美耳球蟲Eimeriaintestinalis、黃艾美耳球蟲E.flavescens、大型艾美耳球蟲E.magna、中型艾美耳球蟲E.media、無殘艾美耳球蟲E.irresidua、梨形艾美耳球蟲E.piriformis、穿孔艾美耳球蟲E.perforans、小型艾美耳球蟲E.exigua、維氏艾美耳球蟲E.vejdovskyi、盲腸艾美耳球蟲E.coecicola等另外10種兔球蟲。兔球蟲在各種類型的兔場中均有較高的感染率，其中腸、黃、大型、中型、斯氏等幾個蟲種具有較強的致病性，能夠引發(fā)家兔產(chǎn)生嚴重的球蟲病。兔群中以剛斷奶至3月齡的仔兔最為易感，發(fā)病死亡率高達60%，耐受個體生長遲緩，飼料轉化率低；成年兔則可常年帶蟲，向環(huán)境中長期排放卵囊。因此球蟲病的存在嚴重影響經(jīng)濟效益，大大制約了養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展(景發(fā), 2011)。普遍認為，疫苗免疫是球蟲病防治最佳手段，上世紀50年代以來，雞球蟲病疫苗已經(jīng)在養(yǎng)雞業(yè)中廣泛應用并取得了巨大成功(Chapmanetal., 2002)。相比而言，兔球蟲病疫苗的開發(fā)則大大滯后，尚無疫苗問世。已有的研究成果已經(jīng)證明兔球蟲具有良好的免疫原性，能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生良好的保護性免疫應答，有著巨大的疫苗開發(fā)潛力。因此本文對近年來家兔抗球蟲免疫以及疫苗開發(fā)的研究進行綜述，為今后的兔球蟲病研究以及疫苗開發(fā)提供相應的參考。

1 家兔抗球蟲免疫

1.1 兔球蟲的免疫原性研究

雞和小鼠的研究表明，艾美耳屬球蟲的感染能夠激發(fā)動物機體產(chǎn)生良好的保護性免疫應答，具有良好免疫原性(Dallouletal., 2006)；同理，感染過球蟲的家兔對同種球蟲的再次感染如有較強抵抗力，表明該兔球蟲同樣具備良好免疫原性。目前對于兔球蟲免疫原性的評價主要集中在：免疫后能否減輕再次感染的臨床癥狀，能否保證體重增長不受影響，以及能否降低卵囊排出量這3個方面。因此，研究人員基于此3個方面對兔球蟲各個蟲種開展大量的研究。

研究表明腸艾美耳球蟲具有強免疫原性。Coudert 等(1993)以6周齡的無球蟲新西蘭白兔為實驗動物，分別接種6、6×102、6×103個腸艾美耳球蟲卵囊進行免疫，14 d后進行1×104個卵囊的攻毒。結果表明，感染6個卵囊后，家兔即可建立一定的免疫力，而感染600個卵囊則能夠對二次感染提供完全的免疫保護。Shi 等(2014)人對腸艾美耳球蟲浙江分離株進了免疫原性鑒定，結果5×102個卵囊所激發(fā)起的免疫應答能夠完全消除1×105個卵囊攻毒所造成的臨床病變，卵囊排出量降低70%，較歐洲分離株的免疫原性稍弱。

Niilo(1967)模仿田間感染規(guī)律，用大型艾美耳球蟲E.magna對家兔進行首免5×102個卵囊，以5 d為間隔，連續(xù)7次，每次劑量增倍的方式免疫，最后一次免疫后12 d攻毒，結果顯示，免疫組可對1×106個卵囊的攻毒產(chǎn)生較好的免疫保護，卵囊排出量相較對照不免疫攻毒組降低3 000倍。Licois等(1995)用2 500個大型艾美耳球蟲歐洲分離株接種6周齡無球蟲新西蘭白兔，在14 d后進行1×104個卵囊的攻毒，結果顯示其對免疫兔的體重增長不再造成任何影響，證明了免疫能夠建立堅實保護。

Norton(1979)對無殘艾美耳球蟲E.irresidua進行了免疫原性研究，在分別接種1×102、1×103、104個卵囊后21 d，以1×106個卵囊進行攻毒。結果顯示，無殘艾美耳球蟲同樣具有良好的免疫原性，1×102個卵囊的免疫即可將攻毒后卵囊排出降低10倍以上，且各個免疫組均未在攻毒后產(chǎn)生臨床癥狀。

黃艾美耳球蟲E.flavescens被普遍認為是免疫原性較差的蟲種，研究表明，只有使用致病劑量的1×104個卵囊進行免疫，才能對28 d后相同劑量的卵囊攻毒產(chǎn)生較好的免疫保護，而其他低劑量的免疫都不能有效抑制攻毒后的體增重降低和卵囊排出(Norton, 1979)。張龍現(xiàn)(1994)的研究也表明只有進行加倍遞增卵囊劑量、多次接種的涓滴免疫策略，才能減輕攻毒后的臨床癥狀和和卵囊排出量，而進行高劑量一次或者低劑量多次的方法都不能有效建立免疫保護。

Pakandl等(2009)將11個種的兔球蟲免疫原性進行劃分，其中腸艾美耳球蟲具有強免疫原性，中型艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲具有中等免疫原性，而黃艾美耳球蟲和梨形艾美耳球蟲則被認為免疫原性較差，但是其并未給出界定免疫原性強弱的明確標準。

有關不同蟲種免疫原性的描述不同研究報道間存在一定差異，可能由以下原因造成：(1)不同試驗所用球蟲分離株不同。由于地理分布差異，各地分離株在生物學特性上存在較大差異，如腸艾美耳球蟲(Shietal., 2014)。(2)實驗動物的差異。不同試驗使用的家兔在日齡和免疫背景上有所不同，而只有使用未感染過球蟲的動物才能正確對免疫原性進行評估。(3)試驗條件的差異。飼料成分、管理水平的差異都會使得出的結論存在差異，因此應將此類因素考慮在內。(4)蟲種鑒定出現(xiàn)的問題(不同蟲種混為一種)。崔平(2012)發(fā)現(xiàn)的一株新的兔艾美耳球蟲的形態(tài)學特征與大型艾美耳球蟲相近似，但生物學特性有著較大差異，因此研究前應對蟲種進行種的鑒定。

1.2 家兔抗球蟲免疫應答特征

自上世紀20年代發(fā)現(xiàn)抗球蟲免疫之后，對于其機理的研究就不斷深入。相較于禽類和鼠球蟲的研究，兔球蟲所激發(fā)免疫應答的研究則屬于起步階段。即便如此，研究人員也獲得了一些較為重要的研究成果。

一般認為腸道黏膜免疫系統(tǒng)介導的局部免疫應答在抗球蟲免疫中起著重要的作用。兔的腸道粘膜免疫系統(tǒng)，包括腸道相關淋巴組織(Gut associated lymphoid tissue, GALT)和腸系膜淋巴結(Mesenteric lymph nodes, MLN)。GALT主要包括盲腸隱突(Vermiform appendix)、圓小囊(Sacculus rotundus)、Peyer氏結(Peyer’s patches, PPs)、腸上皮淋巴細胞(Intestinal intraepithelial lymphocytes, IELs)和固有層淋巴細胞(Lamina propria lymphocytes，LPLs)。其中Peyer氏結表面有著豐富的M細胞(Microfold cell)能夠有效轉運腸道中的抗原物質，而其下方所含有的豐富的樹突狀細胞等抗原遞呈細胞，能夠有效地將抗原遞呈給免疫系統(tǒng)；IELs和LPLs中則含有大量的CD4+和CD8+細胞，介導隨后的細胞免疫應答。兔的盲腸隱突和圓小囊被認為和禽類法氏囊有著相似的結構和功能，與兔抗體多樣性的產(chǎn)生有關，因此在體液免疫應答中發(fā)揮重要作用(Pakandl, 2009)。

1.2.1 兔球蟲激發(fā)的細胞免疫應答研究: 大量研究表明，細胞免疫應答在介導抗球蟲免疫中起著最為重要的作用。Renaux等(2003)研究了腸艾美耳球蟲感染后細胞免疫應答的產(chǎn)生。研究表明，在感染腸艾美耳球蟲14 d后，腸道淋巴細胞的增值能力出現(xiàn)明顯的提高，而參與系統(tǒng)免疫應答的脾臟淋巴細胞的增值能力則沒有出現(xiàn)明顯變化；腸上皮和腸系膜淋巴結中的CD8+T細胞比例和數(shù)量上升，表明這群細胞可能在抗兔球蟲免疫中發(fā)揮重要作用。Pakandl等(2008a)比較了腸艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲的首次感染后激發(fā)免疫應答的特征。結果顯示，兩種球蟲雖然免疫原性相差較大，但是都能激發(fā)良好的黏膜免疫應答，且均以細胞免疫應答為主；但是免疫原性較差的黃艾美耳球蟲在其寄生位點——盲腸，激發(fā)的CD8+T細胞水平不高，因此推斷這可能造成家兔對該種球蟲的再次感染抵抗力差的原因。遺憾的是，以上對于家兔抗球蟲免疫的分子機制研究僅限于初次感染，而對于再次感染后的應答機制則未能研究闡述；而且研究未分析抗原刺激后特異性CD4+/CD8+細胞的應答特征，沒有驗證這些反應是否與保護性應答存在聯(lián)系。綜上所述，兔抗球蟲免疫主要依賴于腸道局部免疫系統(tǒng)，而其中的CD8+T細胞發(fā)揮著重要的作用。

1.2.2 兔球蟲激發(fā)的體液免疫應答研究: 球蟲感染后能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生良好的體液免疫應答，誘導產(chǎn)生大量的抗體，如IgM、IgG和IgA，這些抗體的產(chǎn)生，能夠阻斷子孢子的入侵，參與抗原的交叉遞呈、補體反應等諸多免疫反應(Wallach, 2010)。

斯氏艾美耳球蟲感染家兔后，21 d能檢測到明顯的體液免疫應答，其能夠誘導產(chǎn)生針對卵囊抗原和糞便抗原的特異性抗體(Rose, 1959)。黃艾美耳球蟲感染同樣可以誘導良好的體液免疫應答，感染后15 d可以檢測出血清抗體，25 d IgG的含量達到最高峰；再次感染，即大劑量攻蟲之后抗體水平能夠迅速上升，且維持時間較長；基于黃艾美耳球蟲感染建立的ELISA檢測結果表明球蟲子孢子抗原可能是激發(fā)體液免疫的優(yōu)勢抗原(張龍現(xiàn), 1994)。家兔在初次感染2 000個腸艾美耳球蟲后，雖然能夠激發(fā)起體液免疫應答，但是抗體滴度較低，只有經(jīng)過3次免疫后，才能獲得較高的抗體滴度；遺憾的是其并未進行試驗來驗證這種高水平抗體在抗球蟲免疫中的作用和維持水平(Renauxetal., 2003)。目前普遍認為，體液免疫應答在抗球蟲免疫中僅起輔助作用，但是兔球蟲感染后抗體水平是否與免疫保護的建立有相關性還無定論。張龍現(xiàn)(1994)的研究表明，黃艾美耳球蟲感染后激發(fā)的抗體水平與后期免疫保護沒有相關性；但也有研究表明，斯氏艾美耳球蟲激發(fā)的抗體水平高低能夠反應保護性免疫應答反應的強弱(張龍現(xiàn)，1999)。

目前對于兔抗球蟲體液免疫應答僅限于抗體產(chǎn)生規(guī)律的研究，并未對其發(fā)揮的作用進行深入分析，后期研究應當利用被動免疫等手段去具體驗證抗體所發(fā)揮的功能。

1.2.3 日齡對家兔抗球蟲免疫應答的影響研究: 家兔屬哺乳動物，消化器官和免疫器官在其出生后需要經(jīng)過一定時間的發(fā)育才能最終成熟(Mage, 1998)，因此斷奶前的仔兔對球蟲并不易感，且免疫后也無法建立良好的免疫保護。Pakandl等(2008b)研究了不同日齡未斷奶仔兔感染腸艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲后免疫應答的差異，結果顯示，家兔只有在25日齡之后感染球蟲，才能有效激發(fā)良好的細胞和體液免疫應答；Drouet-Viard(1997)對大型艾美耳球蟲的研究也發(fā)現(xiàn)，對25日齡前的仔兔進行免疫獲得的保護效果并不理想。分析原因可能是斷奶前仔兔消化系統(tǒng)中缺乏子孢子脫囊的膽酸鹽成分，導致了其對球蟲易感性差，球蟲在宿主體內繁殖量少，給免疫系統(tǒng)提供的抗原量不足；其次免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，因此難以產(chǎn)生良好的免疫應答。選擇正確的日齡進行免疫在疫苗應用時十分重要，有關日齡影響免疫保護建立的原因和機理有待進一步研究。

綜上所述，針對兔球蟲的免疫研究雖然已經(jīng)起步，但是研究尚淺，缺乏機理性研究；僅有幾篇關于分子機制的文獻報道后，并無研究跟進，導致了相關領域的研究存在較大的空白，有待于研究人員進一步研究探索。

2 兔球蟲病疫苗的研發(fā)

目前國際公認最好的球蟲病防控策略是利用活卵囊疫苗進行預防，動物經(jīng)口攝入少量球蟲卵囊后，其在動物體內進行繁殖排出體外，而動物通過再次攝入自身排出的已經(jīng)孢子化的卵囊形成再次免疫；經(jīng)過2～3次的反復感染后，動物機體即可建立針對球蟲的堅強免疫保護。因此活蟲疫苗一直是兔球蟲病疫苗研發(fā)的最佳方向。

2.1 活卵囊疫苗的研發(fā)

2.1.1 兔球蟲早熟株的選育: 動物在攝入活卵囊疫苗后會對自身的生產(chǎn)性能造成一定影響，因此使用弱毒蟲株作為疫苗組分是最佳的選擇。Jeffers(1975)利用早熟壓力篩選的方法獲得裂殖生殖代次減少的雞柔嫩艾美耳球蟲早熟株，證明了其在保留免疫原性的同時致病性下降，這為兔球蟲病弱毒活疫苗的研發(fā)開拓了思路。目前已有6個蟲種的兔球蟲早熟蟲株被成功選育。

Licois等(1990)經(jīng)過6代早熟壓力選擇，成功獲得了腸艾美耳球蟲的早熟系，使其潛在期縮短了71 h，系世界首次獲得的兔球蟲早熟株；其同時證明了該早熟株毒力相較原始株有了明顯的降低；此后Licois等(1994)又經(jīng)過12代的選育，獲得了潛在期縮短了36 h的中型艾美耳球蟲E.media的早熟株； 1995年Licois等又成功選育了第3個兔球蟲——大型艾美耳球蟲的早熟株，與原始株相比，潛在期縮短了46 h，致病性顯著降低，繁殖力降低了500倍；Pakandl(2005)則通過連續(xù)18代的選育，獲得了黃艾美耳球蟲的早熟株，潛在期縮短了60 h；第5個被成功選育的是梨形艾美耳球蟲，經(jīng)過12代選育，潛在期從194 h縮短到170 h(Pakandletal., 2006)；另有報道稱Coudert (1995)成功篩選出了盲腸艾美耳球蟲的早熟株，但選育代次和潛在期縮短時間不詳(Pakandl, 2009)。目前我國也開展了兔球蟲早熟株的選育，方素芳(2012)對大型艾美耳球張家口株進行了成功的早熟選育，潛在期與Licois(1995)的研究結果相近。

兔球蟲早熟株在生物學特性的變化上均呈現(xiàn)了一定的相似性。(1)蟲株的毒力出現(xiàn)了明顯下降，1×103個大型艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲都會對仔兔體重增長造成明顯影響，而相同劑量早熟株感染的仔兔與對照組生長則完全相同(Licoisetal., 1991, Licoisetal., 1994)。(2)繁殖力大大下降，大型艾美耳球蟲的早熟株繁殖能力降低了500倍，這種繁殖力的降低可能是由于裂殖生殖代次的減少而造成，兔球蟲早熟株普遍缺少了其生活史中第3代或第4代裂殖生殖。(3)形態(tài)學特征發(fā)生改變，腸艾美耳球蟲子孢子折光體消失，取而代之的則是在孢子囊中出現(xiàn)了一個大的折光體(Licois, 1993)，大型艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲同樣也是由孢子囊的折光體取代了子孢子折光體。但是這種改變并不是普遍現(xiàn)象，黃艾美耳球蟲原始株和早熟株沒有明顯的形態(tài)學差異(Pakandletal., 2003)。

2.1.2 兔球蟲早熟系疫苗的初步研究: 兔球蟲早熟系的成功選育為兔球蟲病疫苗開發(fā)提供了巨大的幫助。Licois等(1995)實驗證明，免疫2 500個早大型艾美耳球蟲早熟株卵囊，能夠對致病劑量的卵囊攻毒起到良好的保護；同樣，1994年Licois等通過接種1 000個中型艾美耳球蟲早熟株，激發(fā)了宿主產(chǎn)生良好的免疫保護，且免疫不會對家兔的體重造成任何影響。

Drouet-viard等(1997)研究了大型艾美耳早熟系蟲株的最適免疫劑量和免疫日齡，認為在仔兔25日齡時免疫3 500個大型艾美耳球蟲早熟株卵囊，能夠對1×104個強毒株卵囊的攻毒產(chǎn)生免疫保護，且不會對體重造成影響，這種有效免疫保護保護建立僅需要9 d；Drouet-viard等(1997)同時也驗證了該早熟珠噴霧免疫的實用有效性，結果證明對于25日齡的仔兔使用4×104個早熟株卵囊進行免疫可以有效的建立免疫保護，抵抗10 d后的攻毒。其結果為今后兔球蟲病疫苗的劑量選擇和免疫方法提供了重要依據(jù)。Akpo等(2012)進行了大型艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲混合免疫攻毒試驗，證明了兩者進行同時免疫后，能夠建立有效的免疫保護，彼此互不干擾，表明兔球蟲病多聯(lián)疫苗開發(fā)的可行性。雖然早熟活卵囊疫苗的研究尚處于實驗室研究階段，但是成功的免疫保護結果都有力的支持了其應用的可行性。

2.1.3 兔球蟲其他致弱毒株的嘗試: γ射線照射的方法曾經(jīng)被用于致弱斯氏艾美耳球蟲，結果顯示通過照射獲得了毒力減弱的蟲株，但是其免疫原性也相對減弱(Pakandl, 2009)；廖黨金(2005)等利用化學試劑致弱的方法，同樣獲得了致弱的斯氏艾美耳球蟲弱毒株，且該致弱毒株能夠對強毒株的感染提供免疫保護。照射γ射線和化學致弱的理論依據(jù)是殺死部分卵囊還是使蟲種本身毒力減弱尚不明確，因此該方法獲得弱毒株免疫研究僅停留在理論研究階段。

2.2 兔球蟲亞單位疫苗的探索研究

尋找球蟲自身優(yōu)勢性保護抗原，是研究抗球蟲免疫應答機制和開發(fā)亞單位疫苗的有效手段。Johnson等(1989)發(fā)現(xiàn)了綿羊棘球蚴絳蟲一個免疫優(yōu)勢抗原Eg95，并通過該抗原的免疫建立了完全的免疫保護，證明了該研究方向的可行性。同時相比于活卵囊疫苗，亞單位疫苗還有著生產(chǎn)成本低，安全性好，操作簡便的優(yōu)勢，因此也是當前球蟲病疫苗研究的熱點之一。

Hanada等(2003)從斯氏艾美耳球蟲感染兔的膽汁中獲得可溶性抗原，該抗原免疫后能夠有效降低攻毒后卵囊的排出量，使肝臟功能指標趨于正常，病理學檢測也表明膽管周圍的淋巴細胞和中性粒細胞數(shù)量增加，蟲體數(shù)量減少。隨后研究發(fā)現(xiàn)，膽汁中能夠激發(fā)高水平體液免疫應答的可溶性抗原主要由裂殖生殖階段的蟲體所分泌，其蛋白大小約為47 kDa。Omata等(2001)利用膽汁抗原對仔兔進行免疫，同時以霍亂毒素B為佐劑，能夠激發(fā)高水平的IgG和分泌型IgA產(chǎn)生；利用免疫印跡檢測方法證明了抗原蛋白主要集中在32、37、49 kDa，由裂殖子階段分泌。Abdel等(2005)同樣利用免疫印跡的方法檢測了斯氏艾美耳球蟲感染后糞便抗原的分布，證明了22和155 kDa處的蛋白能夠與高免血清發(fā)生良好的反應，推斷此處的蛋白可能激發(fā)宿主良好的抗球蟲免疫。以上研究并未對這些蛋白可能的序列進行質譜分析，未發(fā)現(xiàn)特定的兔球蟲抗原，因此離實踐應用還有相當長的一段距離。

上述研究表明，利用兔球蟲的免疫優(yōu)勢抗原進行免疫是可行的，但是目前的研究尚不深入，隨著蛋白組學技術和轉錄組學技術的不斷發(fā)展，更多先進技術應當被應用于兔球蟲免疫優(yōu)勢抗原的尋找中來。

綜上所述，兔球蟲病疫苗的開發(fā)無疑是可行的，但是在獲得一系列的研究結果后，進一步的開發(fā)利用卻趨于停滯，近年來關于兔球蟲疫苗的相關研究基本不見報道，這種現(xiàn)象可能是由于經(jīng)濟、技術以及重視程度等多種原因導致的，但是由于兔產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展、日趨嚴峻的疫病防控前景和公共衛(wèi)生安全對于藥物的嚴格限制，兔球蟲病疫苗仍然是生產(chǎn)中十分迫切需要的。

3 兔球蟲病疫苗開發(fā)展望

鑒于兔球蟲病的巨大危害，養(yǎng)兔生產(chǎn)亟需兔球蟲病疫苗的研發(fā)和使用。雖然雞球蟲病疫苗已經(jīng)投入使用超過半個世紀，且多個種的兔球蟲早熟株也已成功選育，但是仍未有商品化的球蟲病疫苗被開發(fā)利用，因此需要兔球蟲研究人員繼續(xù)不懈努力，開發(fā)安全有效的兔球蟲病疫苗。

通過總結前人的研究經(jīng)驗，在此提出一些進行兔球蟲病疫苗開發(fā)中應當注意的問題：(1)使用無球蟲兔作為實驗動物。球蟲具有良好的免疫原性，試驗前的卵囊感染很可能影響改變家兔的免疫狀態(tài)，影響試驗結果。(2)進行兔球蟲早熟株的選育。兔球蟲致病性較強，使用野毒活卵囊疫苗可能引發(fā)動物較大的疫苗反應，因此使用毒力減弱的卵囊進行免疫能夠有效的降低這種影響。(3)對分離的蟲株進行充分的生物學特性鑒定。由于不同地方分離株在致病性和免疫原性上有著較大差異，因此有必要對其進行準確的鑒定，才能夠判斷其是否具有作為疫苗組分的潛力。(4)雖然雞球蟲已有成熟的疫苗應用，但是由于家兔的生理特性與雞相差較大，且兔球蟲與雞球蟲生物學特性上有著一定不同，因此不能將雞球蟲病疫苗的成功經(jīng)驗直接套用。

長期以來，兔球蟲病始終是嚴重影響?zhàn)B兔經(jīng)濟效益的消化道疾病之一，所以兔球蟲病疫苗在兔業(yè)生產(chǎn)中需要迫切，相信隨著研究的不斷深入，兔球蟲病疫苗的研發(fā)將不斷克服困難，最終獲得成功。