歐紅玲，原杰綜述，陳鳳華，王欣茹審校（解放軍第二炮兵總醫(yī)院：.檢驗(yàn)科；.感染性疾病科，北京 00088）

隨著人類基因圖譜繪制的完成和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，分子診斷技術(shù)成為21世紀(jì)最有潛力的學(xué)科之一。分子診斷是將分子生物學(xué)原理和技術(shù)應(yīng)用于疾病診斷而產(chǎn)生的一門新興的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)技術(shù)，是以疾病相關(guān)基因及其產(chǎn)物為檢測對象，從分子水平來探討疾病發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，從而為疾病的預(yù)防、診斷、療效評估、預(yù)后判斷等提供關(guān)鍵信息和決策依據(jù)。是當(dāng)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要前沿領(lǐng)域之一，其核心是基因診斷技術(shù)。

1 分子診斷的進(jìn)展

分子診斷技術(shù)的開展基于人類對DNA、RNA 和蛋白質(zhì)不斷深入的認(rèn)識，1953年，Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)，為人類揭開了生命本質(zhì)神秘的面紗，為分子診斷的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。1963年，桑格發(fā)明了雙脫氧測序方法，為人類認(rèn)識基因DNA 提供了方向。1972～1973年伯格等創(chuàng)建了重組DNA 技術(shù)，拓展了分子診斷技術(shù)。1976年，Kan等應(yīng)用DNA分子雜交技術(shù)對α地中海貧血進(jìn)行產(chǎn)前診斷，實(shí)現(xiàn)了疾病的早期診斷，標(biāo)志著分子診斷技術(shù)開始應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)中。1985年，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)問世，極大地推動了分子生物學(xué)的發(fā)展，成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和技術(shù)發(fā)展的里程碑。PCR 及其衍生技術(shù)因其操作簡便、快捷、適用性強(qiáng)，成為當(dāng)今分子診斷領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的技術(shù)方法。以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集型技術(shù)，因其支持物上有大量的探針，可以進(jìn)行大量的檢測和分析，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)核酸雜交存在的自動化程度低、檢測目的分子少、低通量等缺點(diǎn)，具有樣品處理能力強(qiáng)、用途廣泛、自動化程度高等特點(diǎn)，成為分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，極大地促進(jìn)了分子診斷學(xué)的發(fā)展。1990年開始啟動人類基因組計劃，到2003年，基因組計劃初步完成后，使分子生物學(xué)研究進(jìn)入了功能基因組學(xué)研究，科學(xué)家們開始探索疾病和藥物耐藥性等與靶基因的相互關(guān)系，使醫(yī)學(xué)模式轉(zhuǎn)向個體化治療臨床研究階段。目前，分子診斷在實(shí)驗(yàn)診斷市場中占的份額還不大，但增長得十分迅速，估計未來10年內(nèi)，分子診斷技術(shù)將在實(shí)驗(yàn)診斷中起主導(dǎo)作用。

2 分子診斷目前在檢驗(yàn)科的應(yīng)用

分子診斷是通過檢測核酸的結(jié)構(gòu)異?；虻鞍椎谋磉_(dá)異常，對疾病或潛在疾病作出試驗(yàn)診斷，分子診斷的技術(shù)方法決定了試驗(yàn)診斷的應(yīng)用。分子診斷的內(nèi)容從單一診斷遺傳性疾病發(fā)展到一個全新階段，廣泛應(yīng)用于感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤診斷等多個領(lǐng)域。當(dāng)前分子診斷學(xué)在臨床應(yīng)用主要有下面幾個方面。

2.1 在感染性疾病診療中的應(yīng)用近年來不斷突發(fā)一些傳染性極強(qiáng)的新病原體，如非典型性呼吸綜合征（SARS）、H1N1甲型流感、H7N9禽流感，嚴(yán)重影響了公眾的健康和社會的安定。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、病毒分離等病原學(xué)檢測技術(shù)普遍存在耗時長、靈敏度差等不足，有些病原體還有臨床分離和培養(yǎng)難度大等特點(diǎn)，大大降低了檢測效率，難以在臨床抗感染治療中發(fā)揮有效的指導(dǎo)作用。隨著各種病原體基因結(jié)構(gòu)的闡明，利用分子診斷技術(shù)能早期、快速、敏感、特異地檢測感染性病原體的DNA 或RNA。目前，與醫(yī)學(xué)相關(guān)的幾乎所有病原微生物均建立了PCR 檢測方法［1－2］，可通過特異引物擴(kuò)增來檢測病原微生物的目標(biāo)基因或者是通過通用引物擴(kuò)增檢測細(xì)菌的16S rRNA 和真菌28SrRNA 基因序列，整個檢測過程耗時2～4 h，與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，敏感度和特異度大大提高，所以廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域?，F(xiàn)在PCR 又發(fā)展到多重PCR、巢式PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR 以及實(shí)時定量PCR 等。2000年日本學(xué)者Notomi等［3］公開了一種新的基因診斷技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)（LAMP），受到了世界衛(wèi)生組織（WHO）和各國學(xué)者的關(guān)注，短短幾年，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)和醫(yī)學(xué)研究中，成功地應(yīng)用于SARS、禽流感、HIV 等疾病的檢測中［4－6］，在甲型H1N1流感事件中，日本榮研化學(xué)公司接受WHO 的邀請進(jìn)行H1N1環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）試劑盒的研制。通過榮研公司近十年的推廣，LAMP 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于日本國內(nèi)各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進(jìn)出口快速診斷中，并得到了歐美國家的認(rèn)同。LAMP 方法的優(yōu)勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設(shè)備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果的檢測僅通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成即可判斷，簡便快捷，適合基層快速診斷。使對病原微生物的分子診斷方法得到很大的改進(jìn)。分子診斷不僅可以快速對病原體進(jìn)行診斷和鑒別診斷，還可進(jìn)行病原分型，以及病毒載量檢測，從而為個體化治療提高依據(jù)。

另外，細(xì)菌等病原微生物的耐藥性問題也成為臨床醫(yī)生面臨的一個難題，即達(dá)不到預(yù)期療效，也存在醫(yī)療資源的浪費(fèi)，容易激化醫(yī)患矛盾。細(xì)菌的耐藥基因檢測可有助于醫(yī)生有針對性地選擇和使用抗菌藥物，設(shè)計新型抗菌藥物，對臨床正確用藥和新藥開發(fā)具有指導(dǎo)意義。各種病原菌耐藥基因檢測是當(dāng)前耐藥機(jī)制研究的熱點(diǎn)，通過設(shè)計引物、PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因片段、對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析或測序比對，獲得檢測結(jié)果，對耐藥菌株的早期檢出能夠及時準(zhǔn)確使用抗菌藥物減少耐藥株的產(chǎn)生，同時控制耐藥性的傳播。張苑怡等［7］使用LAMP 技術(shù)以NDM－1基因?yàn)榘谢驒z測多重耐藥菌中產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶。Hanaki等［8］通過LAMP 技術(shù)檢測MecA 和femB 及qacA／B基因來鑒定耐消毒劑的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），能在1h內(nèi)做出敏感性和特異性較高的結(jié)果。

2.2 遺傳性疾病目前已知的遺傳病有數(shù)千種，盡管一些遺傳病的發(fā)病率很低，但是一旦患病，患者的生活質(zhì)量將大大降低，甚至無法生存，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。隨著人類基因組計劃的逐步完成，人類已掌握了幾乎所有已發(fā)現(xiàn)的遺傳病基因，通過遺傳病分子診斷從基因方面進(jìn)行篩查，可以避免遺傳病患兒的出生，或者是盡早采取措施，提高患者的生活質(zhì)量，減輕患者及家庭的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。所以臨床分子診斷對遺傳性疾病的診斷和產(chǎn)前篩查具有重要的意義。通過對血清或血漿進(jìn)行PCR 檢測法布瑞氏癥，使用微滴PCR 檢測遺傳性耳聾、使用改良的反轉(zhuǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（I－PCR）檢測血友病A、通過PCR 聯(lián)合低密度基因芯片技術(shù)的導(dǎo)流雜交可簡便、快速地從孕婦血漿中檢測20種常見胎兒地中海貧血等［9－12］。

2.3 腫瘤經(jīng)過長期、大量的研究，科學(xué)家對腫瘤的認(rèn)知逐漸鎖定到相應(yīng)的基因方面，人類基因組序列和高通量分子分析技術(shù)的發(fā)展，使分子診斷技術(shù)在腫瘤的診治方面得到快速發(fā)展，人們能夠從DNA、RNA 和蛋白質(zhì)水平上對腫瘤進(jìn)行全面研究，從個體基因組中分析和鑒別患者之間存在的疾病相關(guān)個體差異，利用這些差異來合理指導(dǎo)臨床治療，推動了腫瘤的個體化治療方向［13］。38歲的好萊塢紅星安吉麗娜·朱莉通過基因檢測發(fā)現(xiàn)其乳腺癌易感基因BRCA1缺陷，切除雙乳以預(yù)防乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生［14］。提示基因檢測在腫瘤的診斷領(lǐng)域?qū)⒂泻艽蟮陌l(fā)展。對于腫瘤的個體化治療比較有代表意義的是對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的靶向性治療，約20%的NSCLC患者是由于表皮生長因子受體（EGFR）的突變導(dǎo)致的［15］，EGFR是一種酪氨酸激酶，常見的突變發(fā)生于EGFR 的外顯子18～21上［16］。外顯子18、19、21、20（S769I）參與酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的編碼，突變導(dǎo)致EGFR 活性增加，磷酸化水平明顯升高，下游的增殖通路被激活，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和惡化。因此，針對此類因基因突變引起的NSCLC，使用EGFR 酪氨酸激酶受體抑制劑（EGFT－TKIs）可有效抑制腫瘤。而如果是外顯子20（T790M）發(fā)生突變，則對EGFT－TKIs具有耐藥性，因此美國食品與藥品監(jiān)督管理局要求在使用藥物EGFR－TKIs之前要先進(jìn)行基因檢測，確定分子分型。并且對18～21外顯子的突變可通過血漿對來自腫瘤的微量DNA 進(jìn)行檢測，為臨床上不能手術(shù)，同時不愿穿刺的患者提供了一種創(chuàng)傷小的替代檢測方案。

3 展望

分子診斷學(xué)將成為2l世紀(jì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的主題。分子診斷技術(shù)將朝著高效、便捷、靈敏和無創(chuàng)傷性的方向發(fā)展；21世紀(jì)分子診斷學(xué)的技術(shù)優(yōu)勢和巨大潛力，尤其是生物芯片的發(fā)展，將成為最有希望為改善世界各國人們的健康狀況做出貢獻(xiàn)的生物技術(shù)之一。隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質(zhì)組計劃的啟動，分子診斷方法將極大地推動現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，通過一滴血、一滴尿以及其他體液或組織，就可以簡單、方便地檢測幾乎所有的病原微生物、一些遺傳病基因和腫瘤標(biāo)記物、還可以同步建成是否存在耐藥基因及耐藥位點(diǎn)的突變，并可以在更深層次揭示疾病的本質(zhì)，指導(dǎo)臨床診治。

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