郭變琴，陸蕓瑤，黃學(xué)梅（重慶市腫瘤研究所檢驗(yàn)科 400032）

Wnt信號通路不僅在胚胎發(fā)育調(diào)控中起重要作用，而且它與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也息息相關(guān)，并在多種腫瘤中得到證實(shí)，是現(xiàn)今腫瘤研究的熱點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)，人類Wnt基因家族共有19個(gè)成員，它們編碼的產(chǎn)物均為分泌型糖蛋白，含一段信號肽及23或24個(gè)位置保守的半胱氨酸殘基［1］。Wnt2是經(jīng)典Wnt信號通路的成員之一，目前被廣泛認(rèn)為是一種癌基因，該基因定位于染色體7q31.3上。近年相繼發(fā)現(xiàn)，Wnt2在某些腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如結(jié)腸癌、胃癌、食管腺癌等［2－4］。本課題前期研究表明Wnt2在乳腺癌組織中高表達(dá)，又基于Wnt2是一種分泌型糖蛋白，作者進(jìn)一步探討Wnt2在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、肝癌患者血清中的水平，為深入研究Wnt2在腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇重慶市腫瘤醫(yī)院住院的腫瘤患者77例作為研究對象，其中乳腺癌38例、卵巢癌10例、宮頸癌8例、肺癌13、肝癌8例。所有患者均為女性且均經(jīng)病理確診，所有標(biāo)本除乳腺癌有2例為術(shù)后正接受化療外，其余病例均為術(shù)后復(fù)發(fā)就診患者。選擇同期在重慶市腫瘤醫(yī)院健康體檢的30例健康成年女性作對照，排除乳腺增生。所有研究對象均征得本人知情同意。

1.2 儀器與試劑人無齒型MMTV 整合位點(diǎn)成員酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于武漢華聯(lián)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集研究對象均于清晨空腹采集肘靜脈血，2h內(nèi)分離血清，分裝后于－80℃低溫冰箱保存待檢；檢測前融解，并進(jìn)一步離心，待檢。

1.3.2 檢測方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測可溶性Wnt2在血清中的水平。（1）96孔酶標(biāo)反應(yīng)板中，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品10孔（稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為6、4、2、1、0.5 ng／mL）、空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔；（2）在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育30min，洗板5次，每次均拍干；（3）每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外，37℃溫育30min，洗板5次，每次均拍干。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；（4）每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔吸光度（A值）；（5）以血清Wnt2標(biāo)準(zhǔn)品的A值為縱坐標(biāo)（取雙復(fù)孔濃度的平均值），標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算出待測血清Wnt2水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

健康者血清中Wnt2水平為（1.23±0.69）ng／mL，乳腺癌患者為（7.22±3.26）ng／mL，卵巢癌患者為（5.55±3.89）ng／mL，宮頸癌患者（8.89±3.68）ng／mL，肝癌組患者（0.02±0.02）ng／mL，肺癌患者為（0.88±0.35）ng／mL；與健康者比較，乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌患者血清中Wnt2水平均明顯升高（均P＜0.05），肝癌患者血清中Wnt2水平明顯降低（P＜0.05），肺癌患者血清中Wnt2水平無明顯變化（P＞0.05）。

3 討論

Wnts是一類廣泛存在的分泌型糖蛋白，相對分子質(zhì)量約40×103，通過與細(xì)胞表面、細(xì)胞外基質(zhì)的聯(lián)系而體現(xiàn)信使的作用，再通過復(fù)雜的信號傳遞通路控制胚胎早期發(fā)育，決定細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及生長調(diào)節(jié)，而當(dāng)其影響因素發(fā)生變化使其活化過度或失調(diào)時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)育異常或形成腫瘤［5］。目前，Wnt2被廣泛認(rèn)為是一種致癌基因，然而，其在腫瘤中的作用報(bào)道不多。有研究證實(shí)，食管細(xì)胞癌中，腫瘤纖維母細(xì)胞分泌的Wnt2通過激活Wnt2－β連環(huán)蛋白信號通路，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生長［6］；此外，Wnt2能通過自分泌或旁分泌實(shí)途徑誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變［7］；尤其是新近對Wnt2的報(bào)道引起了作者極大的興趣，麻省總醫(yī)院癌癥中心的研究人員通過芯片設(shè)備成功捕獲了人胰腺癌小鼠模型血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并分別對胰腺循環(huán)腫瘤細(xì)胞、原發(fā)腫瘤細(xì)胞和正常胰腺組織進(jìn)行了RNA 表達(dá)水平分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt2基因在胰腺癌中的表達(dá)量高于正常組織，尤其在循環(huán)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中表達(dá)量特別高［8］。又鑒于Wnt基因編碼的產(chǎn)物為分泌型糖蛋白，并含有一段信號肽，因此作者推測Wnt2可分泌至腫瘤患者血清中。

以往研究者對Wnt2的研究主要聚焦在腫瘤組織或細(xì)胞株中，對于腫瘤患者血清中Wnt2的表達(dá)水平，尚未見研究報(bào)道。本課題組在前期對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt2高表達(dá)在乳腺癌組織上皮及間質(zhì)細(xì)胞中。在本研究中，作者進(jìn)一步收集了乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、肝癌的患者血清，并通過ELISA 技術(shù)檢測Wnt2在血清中的水平，與健康者比較，乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌患者血清中Wnt2水平均明顯升高（均P＜0.05），肝癌患者血清中Wnt2水平明顯降低（P＜0.05），肺癌患者血清中Wnt2水平無明顯變化（P＞0.05）。由此可見，Wnt2在婦科腫瘤患者血清中的水平明顯增加。有研究也表明，BRCA1及BRCA2基因是卵巢癌的高危遺傳基因。Jazaeri［9］采用cDNA 基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)攜帶BRCA2基因的卵巢癌與Wnt2和SFRP4密切相關(guān)，該結(jié)果也間接提示了Wnt2與卵巢癌的相關(guān)性。結(jié)合本課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測Wnt2在婦科腫瘤的發(fā)生中可能起著重要作用，然而其在婦科腫瘤中的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中作者也發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較，肝癌患者血清中Wnt2水平明顯降低。而最近文獻(xiàn)［10］報(bào)道，通過對一個(gè)70%肝切除的肝臟再生小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，Wnt2在觸發(fā)肝細(xì)胞的再生中起一定作用。但本研究所選肝癌病例為術(shù)后復(fù)發(fā)就診患者，因而肝臟的再生能力較健康人降低，這可能是肝癌患者血清中Wnt2水平較健康人低的原因。

此外，本課題中宮頸癌、卵巢癌、肺癌及肝癌所收集的樣本量偏小，因此本課題所得出的結(jié)果僅僅是初步的，后續(xù)尚需大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。在下一步的試驗(yàn)中，作者將通過組織芯片技術(shù)，來檢測處于不同臨床分期的婦科腫瘤中Wnt2的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討Wnt2在婦科腫瘤中的作用機(jī)理，若試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Wnt2在婦科腫瘤中的表達(dá)量與惡性程度相關(guān)，作者將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步收集不同惡性程度的婦科腫瘤患者血清，來證實(shí)Wnt2在婦科腫瘤患者血清中的表達(dá)與婦科腫瘤惡性程度是否相關(guān)，是否能作為婦科腫瘤的篩查、預(yù)后評估、預(yù)后監(jiān)測的指標(biāo)而應(yīng)用于臨床。

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