嚴(yán)子琴，劉麗，劉俊，施思，李海龍，蔣哲，孟凡國，周海夢(mèng)，徐蓓，丁先鋒，胡衛(wèi)江，歐文斌△（.浙江清華長三角研究院／浙江省應(yīng)用酶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／生物分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，浙江嘉興 4006；.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 000；.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 008）

人源甲胎蛋白（AFP）是一種腫瘤相關(guān)的單鏈糖蛋白，其糖鏈部分具有癌胚性變化的特征。AFP為胎兒時(shí)期肝臟合成的一種胚胎蛋白，出生1周后表達(dá)消失，以后完全被清蛋白所替代［1－3］。健康人不表達(dá)AFP，當(dāng)患肝細(xì)胞癌、卵黃囊和胚胎樣腫瘤及部分肝外腫瘤時(shí)機(jī)體可重新合成AFP，因此臨床上AFP被當(dāng)成一種肝癌及生殖細(xì)胞腫瘤的經(jīng)典血清標(biāo)志物來使用，且對(duì)良惡性腫瘤的診斷、腫瘤治療的療效監(jiān)測及腫瘤預(yù)后都具有重要臨床意義［4－5］。本文從真核（畢赤酵母GS115）蛋白表達(dá)體系入手，研究人源AFP的重組克隆、異源高效表達(dá)、蛋白純化及臨床活性分析，為研制AFP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其可溯源校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和體外診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和培養(yǎng)基質(zhì)粒pReceiver－AFP 由復(fù)能基因合成。質(zhì)粒pPICZαA 購自Invitrogen。DH5α、BL21（DE3）和GS115均為本實(shí)驗(yàn)室保存。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂。BMGY 培養(yǎng)基：1mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）10%，10×酵母無氨基氮源（YNB）10%，10×甘油10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。BMMY 培養(yǎng)基：1mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）10%，10×YNB 10%，10×甲醇10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。

1.2 肝癌血清標(biāo)本選擇3例臨床肝癌患者血清標(biāo)本，標(biāo)為1、2、3號(hào)。1號(hào)標(biāo)本為女患者的血清，年齡50歲，AFP 為281661.00ng／mL，治療期給予的抗病毒藥物為阿德福韋酯；2號(hào)標(biāo)本為男患者的血清，年齡28歲，AFP 為80200.45ng／mL，治療期間未給予抗病毒藥物治療；3號(hào)標(biāo)本為女患者的血清，年齡44歲，AFP為2013.18ng／mL，治療期給予的抗病毒藥物為阿德福韋酯。3例患者的肝癌類型均為巨塊型。

1.3 儀器與試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自大連寶生物公司；DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）免疫印跡試驗(yàn)（WB）檢測試劑盒購自Millipore公司；抗His兔多抗與抗AFP 鼠單抗購自Santa Cruz Biotechnology；抗兔與抗鼠二抗均購自GE Healthcare。

1.4 構(gòu)建重組人源AFP 酵母表達(dá)載體以質(zhì)粒pReceiver－AFP為模板，上游引物CGC CGG AAT TCA TGA AGT GGG TGG AAT CAA T（含EcoRⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)），下游引物CTA GTC TAG AAA CTC CCA AAG CAG CAC GAG（含XbaⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)），聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增帶雙酶切識(shí)別位點(diǎn)的afp目的基因片段，再將畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA 和afp PCR 擴(kuò)增基因片段同時(shí)用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后經(jīng)T4 DNA 連接酶連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA－AFP。測序結(jié)果與GeneBank公布的AFP序列完全一致。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZαA－AFP經(jīng)電轉(zhuǎn)化法（Bio－Rad電轉(zhuǎn)儀）轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。選取經(jīng)PCR 鑒定為陽性單克隆的4株重組菌株即UNT－AFP－1、UNT－AFP－4、UNT－AFP－5和UNT－AFP－6，接種于15mL BMGY 培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到2～6，2500r／min 離心5 min，棄上清液，用20mL BMMY 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30℃振蕩培養(yǎng)甲醇（0.5%）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)開始后每隔24h取樣，標(biāo)本經(jīng)8000r／min離心1min，將上清液和細(xì)胞沉淀分離并放置在4℃下。同時(shí)，補(bǔ)加無菌的100%甲醇至終濃度為0.5%以維持誘導(dǎo)。

1.6 SDS－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）及WB 將經(jīng)過處理后的蛋白進(jìn)行10%SDS－PAGE，電泳完畢后1塊膠考馬斯亮藍(lán)染色，蛋白條帶通過全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。另1塊膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，抗AFP鼠單克隆一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）沖洗后加抗鼠二抗室溫孵育1h，通過ECL 用Quant LAS 4000 mini進(jìn)行曝光成像［7］。將AFP 高表達(dá)菌株即UNT－AFP－4接于2L 的搖瓶中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每間隔24h取樣并補(bǔ)加甲醇，持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4d，將樣本處理后進(jìn)行Western blot檢測分析及蛋白量測定。將第4天的發(fā)酵液離心后收集上清液，硫酸銨分級(jí)沉淀純化蛋白，HPLC 分析其純度、Western blot和電化學(xué)發(fā)光法分別檢測其免疫反應(yīng)性和水平。

1.7 重組蛋白AFP的純化及測定

1.7.1 重組蛋白AFP的純化畢赤酵母GS115分泌表達(dá)的AFP不帶His標(biāo)簽，用硫酸銨分級(jí)沉淀（30%、55%、75%）進(jìn)行純化。

1.7.2 AFP蛋白純度水平測定純化的AFP純度用安捷倫1200HPLC儀測定。蛋白水平定值由嘉興市第一醫(yī)院羅氏E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀分析測定，試劑為羅氏原裝進(jìn)口。

2 結(jié)果

2.1 重組人源AFP在畢赤酵母GS115中的高表達(dá)株篩選甲醇誘導(dǎo)目的蛋白AFP在GS115中表達(dá)，篩選UNT－AFP（即不帶His和c－myc標(biāo)簽的AFP）的高表達(dá)株。挑取4株經(jīng)PCR 鑒定為陽性克隆菌株，即UNT－AFP－1、UNT－AFP－4、UNT－AFP－5和UNT－AFP－6分別用15mL BMMY 培養(yǎng)基進(jìn)行小量搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)。Western blot檢測AFP表達(dá)情況，并用電化學(xué)發(fā)光法檢測AFP水平。在70×103附近有特異性蛋白條帶，而pPICZαA／GS115陰性對(duì)照在此位置沒有條帶。進(jìn)一步對(duì)重組表達(dá)的AFP 進(jìn)行定量檢測，AFP 在UNT－AFP－1中水平為316.7ng／mL；在UNT－AFP－4中為402.1ng／mL；在UNT－AFP－5中為334.6ng／mL；在UNT－AFP－6中為259.7 ng／mL。其中UNT－AFP－4的表達(dá)量相對(duì)最高，因此選此菌株進(jìn)行后續(xù)的蛋白表達(dá)純化。

2.2 重組人源UNT－AFP－4在畢赤酵母GS115中的大搖瓶表達(dá)及純化結(jié)果AFP能在酵母GS115中穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)酵第4天AFP 的特異性條帶最亮，檢測其AFP 水平為102.9 ng／mL。

2.3 HPLC 分析經(jīng)硫酸銨沉淀后的AFP HPLC 圖譜上出現(xiàn)兩個(gè)峰，出現(xiàn)時(shí)間分別是2.078、2.752 min，峰面積分別是34923.9和408.5，AFP 的峰面積占總峰面積的98.844%，即經(jīng)55%硫酸銨沉淀后的AFP純度為98.844%。Western blot檢測到AFP特異性免疫反應(yīng)條帶。電化學(xué)發(fā)光法檢測AFP含量分別是3473ng／mL（55%硫酸銨集份）和76.7ng／mL（75%硫酸銨集份）。據(jù)此計(jì)算，55%硫酸銨集份含有87%的AFP蛋白。

2.4 Western blot分析經(jīng)硫酸銨沉淀后的AFP 將55%硫酸銨沉淀后收集的AFP與臨床肝癌血清標(biāo)本進(jìn)行Western blot比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的AFP與臨床肝癌血清標(biāo)本的分子大小相當(dāng)，表明二者糖基化水平相近。

3 討論

目前，肝癌檢查主要包括血清AFP 和肝臟影像學(xué)檢查［6－8］。檢測AFP是當(dāng)前診斷肝癌最簡便、靈敏、快捷的方法，在臨床上被認(rèn)為是肝癌的經(jīng)典腫瘤標(biāo)記物，因而被當(dāng)作診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)［9］。

最近研究表明，AFP有其復(fù)雜的生物學(xué)功能。文獻(xiàn)［6］報(bào)道發(fā)現(xiàn)AFP與腫瘤細(xì)胞的惡性生長、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，并且認(rèn)為AFP是肝癌細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，研究結(jié)果顯示AFP具有潛在的抗凋亡誘導(dǎo)作用的生物學(xué)性質(zhì)。最新的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)AFP具有抑制抑癌基因的生物學(xué)功能，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐受全反式維A 酸誘導(dǎo)的凋亡。

在此研究中，作者前期也研究了AFP 在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達(dá)，與劉繼洪［4］發(fā)現(xiàn)AFP 在大腸桿菌中能表達(dá)的結(jié)果相符。但在研究重組AFP 表達(dá)的過程中，重組人源AFP在BL21（DE3）中的表達(dá)主要存在于包涵體中，必須通過變、復(fù)性才能獲得有免疫原性的目的蛋白，且經(jīng)純化得到的AFP水平只有360.2ng／mL，因此結(jié)果沒有在本文中列出。此外，原核表達(dá)獲得的AFP與人源AFP相比相對(duì)分子質(zhì)量較小，分析其原因可能與其無糖基化和蛋白折疊的差異有關(guān)。相較于此，在GS115中表達(dá)的AFP均能分泌到胞外易于目的蛋白的收集，且經(jīng)硫酸銨的初步純化后純度就可達(dá)90%以上，活力是BL21（DE3）中表達(dá)的AFP的10倍之多。此外，將GS115中表達(dá)純化后獲得的AFP與臨床肝癌血清標(biāo)本進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的比較，發(fā)現(xiàn)在GS115中異源表達(dá)的人源AFP相對(duì)分子質(zhì)量與肝癌血清標(biāo)本相近，其糖基化水平可能相近，但確切的結(jié)論還需要進(jìn)一步的研究論證。

目前，AFP主要是從嚙齒類動(dòng)物胚胎和人胚胎血清中提取獲得，通過此方法獲得的AFP量少，而通過酵母表達(dá)和純化可獲得大量的且具有免疫原性的高純度AFP。當(dāng)前臨床AFP檢測上，仍然呈現(xiàn)外國診斷試劑盒獨(dú)當(dāng)一面的趨勢，國內(nèi)相應(yīng)的體外診斷試劑盒和校準(zhǔn)品、質(zhì)控品還相對(duì)空白。本研究可為將來制備體外診斷試劑盒、可溯源的AFP校準(zhǔn)品、質(zhì)控品以及更多AFP新功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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