霍 佳，錢俊喬，李陳莉，樋口京一，郭淺妤，錢金澤

淀粉樣變性是一組由蛋白錯(cuò)誤折疊引起的，以淀粉樣蛋白纖維沉積于各種組織間質(zhì)為特征的，引發(fā)多系統(tǒng)損傷的全身性疾病。目前，已發(fā)現(xiàn)28種不同的前體蛋白可在活體中形成淀粉樣蛋白，并伴隨正常組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致相應(yīng)器官功能障礙而引起的一系列病理改變，如朊病毒病(prion diseases)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)、II型糖尿病、家族性淀粉樣多神經(jīng)病(familial amyloid polyneuropathy, FAP)等[1]。

載脂蛋白A-II(apoA-II)主要存在于人類、小鼠、大鼠和魚的血漿中[2-3]。而對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)，apoA-II是其血清高密度脂蛋白的第二大組成成分，并通過(guò)成核現(xiàn)象(nucleation)和纖維延伸(extension)過(guò)程形成淀粉樣載脂蛋白A-II(amyloid apoA-II, AApoAII)纖維沉積于各器官中而引起小鼠老化淀粉樣變(mouse senile amyloidosis)[4]。研究已知，AApoAII纖維也可以通過(guò)糞、乳汁、唾液等途徑誘發(fā)系統(tǒng)性淀粉樣變的發(fā)生[5-6]，并且這種老化相關(guān)的AApoAII纖維可沉積于腦實(shí)質(zhì)和骨髓以外幾乎所有的器官和組織中，如肝臟、脾臟、胃、腸、心臟、腎臟、肺、舌、皮膚和唾液腺等。目前研究發(fā)現(xiàn)，朊病毒可通過(guò)多種感染途徑(如消化道，血液等途徑)感染各種組織器官，而朊病毒感染的人、鹿及羊的骨骼肌中均檢測(cè)出scrapie樣異常朊病毒(PrPSc)，并且該類疾病亦可通過(guò)骨骼肌進(jìn)行種屬間和/或種屬內(nèi)傳播[7-8]。AApoAII淀粉樣纖維作為已知的一種淀粉樣變前體蛋白，具有與朊病毒相似的傳播性及傳播途徑，但AApoAII淀粉樣纖維是否可以通過(guò)肌肉進(jìn)行種內(nèi)傳播未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用R1.P1-Apoa2c小鼠誘發(fā)系統(tǒng)性淀粉樣變，并使用Pras’的方法從骨骼肌中提取AApoAII淀粉樣纖維，成功地進(jìn)行了系統(tǒng)性淀粉樣變的二次傳播實(shí)驗(yàn)。本研究首次驗(yàn)證了小鼠老化淀粉樣變的骨骼肌傳播途徑，為淀粉樣變疾病的發(fā)生機(jī)制及防治方法提供了新的有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 R1.P1-Apoa2c雌性小鼠，60日齡，共計(jì)17只，由日本信州大學(xué)加齡生物學(xué)研究室提供。將實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行分組：實(shí)驗(yàn)1組6只、實(shí)驗(yàn)2組5只、實(shí)驗(yàn)3組6只。

1.2模型制備 參照Pras’的方法，從淀粉樣變誘導(dǎo)后20個(gè)月的R1.P1-Apoa2c小鼠肝臟中提取AApoAII淀粉樣纖維種子[9]，并用蒸餾水稀釋濃度至1.0 mg/mL。將稀釋液用超聲打碎后，采用尾靜脈注射法進(jìn)行淀粉樣變模型制備，R1.P1-Apoa2c小鼠注射量為100 μg/只。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)月后，根據(jù)Amyloid Index評(píng)估心、肝、脾、胃、腸、舌、皮膚各組織淀粉樣變沉積程度,分為0～4級(jí)：0級(jí)，無(wú)淀粉樣沉積物；1級(jí)，約<10%的組織中可見(jiàn)淀粉樣沉積物；2級(jí)，約10%～30%的組織中可見(jiàn)淀粉樣沉積物；3級(jí)，30%～50%的組織中可見(jiàn)淀粉樣沉積物；4級(jí)，>50%的組織中可見(jiàn)淀粉樣沉積物。淀粉樣變沉積程度為0級(jí)以上即為造模成功[5]。

1.3組織標(biāo)本的取材 待淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)月后即取材。對(duì)手術(shù)器械、手術(shù)操作臺(tái)及小鼠進(jìn)行消毒，用乙醚對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行麻醉，將采集的肝臟、心臟、脾臟、皮膚、舌、腸、胃分別置于福爾馬林及2.5%的戊二醛中，以便進(jìn)行淀粉樣變程度的判斷及部位的判定。

1.4剛果紅染色 將福爾馬林固定好的組織樣品進(jìn)行剛果紅染色，并通過(guò)偏光顯微鏡觀察淀粉樣沉積程度及位置。

1.5免疫組織化學(xué)染色 將福爾馬林固定好的組織樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，使用鼠apoA-II抗體，稀釋濃度為1∶3 000，以特異性判定淀粉樣變沉積的程度及部位。

1.6電鏡觀察 將經(jīng)2.5%的戊二醛固定好的組織樣品用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，并用1%鋨酸固定液固定。經(jīng)乙醇、丙酮脫水后進(jìn)行包埋、固化。制備超薄切片，厚度為100 nm，隨后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，進(jìn)行電鏡觀察，以判定淀粉樣變沉積部位。

1.7骨骼肌中apoA-II mRNA檢測(cè)。

1.7.1cDNA合成 使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)從骨骼肌中提取總RNA。利用First strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia Biotech, USA)合成cDNA, 并通過(guò)使用Taq DNA polymerase(Promega, USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳分離，紫外透射儀上觀察結(jié)果。

1.7.2Real-time PCR 使用SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japan)及7500 Real-Time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。上游引物序列為5′-AAGAGACAGGCGGACGGACA-3′，下游引物序列為5′-GAGGTCTTGGCCTTCTCCAC-3′。

1.8骨骼肌中ApoAI蛋白檢測(cè) 參照Pras’的方法，從各部骨骼肌中(肱三頭肌、股四頭肌、胸大肌和背最長(zhǎng)肌)提取AApoAII纖維蛋白，采用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜后用1∶3 000稀釋度的apoA-II抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.9二次傳播實(shí)驗(yàn) 參照Pras’的方法，從骨骼肌中提取AApoAII纖維蛋白，作為“種子”，采用尾靜脈注射法進(jìn)行淀粉樣變二次傳播實(shí)驗(yàn)的誘發(fā)，“種子”注射量為100 μg/只。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)月后，根據(jù)上述Amyloid Index方法判斷淀粉樣沉積情況。同時(shí)，將骨骼肌中提取的AApoAII纖維“種子”進(jìn)行6 mmol/L鹽酸胍室溫慢速攪拌24 h變性處理，對(duì)照實(shí)行二次傳播實(shí)驗(yàn)。R1.P1-Apoa2c雌性小鼠，60日齡，共計(jì)12只，將實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行分組：陰性對(duì)照組3只、誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組3只、鹽酸胍變性處理組6只。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用StatView software package (Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)使用Mann Whitney U test進(jìn)行兩組比較。

2 結(jié) 果

2.1apoA-II mRNA在肌肉組織中的表達(dá) 瓊脂糖凝膠電泳圖像顯示淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行后，R1.P1-Apoa2c小鼠模型各部分肱三頭肌、股四頭肌、胸大肌和背最長(zhǎng)肌骨骼肌中均有apoA-II mRNA的表達(dá), 但4個(gè)部位骨骼肌的mRNA表達(dá)程度不盡相同，分別為胸大肌>豎脊肌>肱三頭肌>股四頭肌，此外，Real-Time PCR結(jié)果顯示肌肉組織中apoA-II mRNA的表達(dá)程度低于肝臟中apoA-II mRNA的表達(dá)程度。

圖1 apoA-II mRNA 在肌肉組織中的表達(dá)

2.2ApoA-II蛋白在肌肉組織中的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示各部分骨骼肌中均有ApoA-II蛋白的表達(dá)，且胸大肌中的表達(dá)程度最顯著。

圖2 ApoA-II蛋白在肌肉組織中的表達(dá)

2.3形態(tài)學(xué)觀察淀粉樣纖維在肌肉組織中沉積部位 剛果紅及免疫組化染色結(jié)果顯示AApoAII淀粉樣纖維主要沉積在血管壁(A和C)上及肌纖維之間的間質(zhì)(B和D)(圖3)。(A和B為剛果紅染色，C和D為免疫組化染色。放大倍數(shù)×400)

2.4電鏡觀察淀粉樣纖維在肌肉組織中沉積情況 電鏡結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色和剛果紅染色一致(圖4),骨骼肌組織中可見(jiàn)直徑約為8～10 nm纖維結(jié)構(gòu)(如箭頭所示)。

圖3 淀粉樣纖維在肌肉組織中沉積部位

圖4 淀粉樣纖維在肌肉組織中沉積情況的電鏡觀察

2.5二次傳播實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)二次傳播實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，AApoAII淀粉樣纖維沉積的骨骼肌中提取物(圖5)可引起系統(tǒng)性淀粉樣變; 而提取物進(jìn)行變性處理后不能誘發(fā)二次系統(tǒng)性淀粉樣變(圖6，表1)。

圖5 肌肉組織提取物中淀粉樣纖維組分

圖6 剛果紅染色觀察二次傳播實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組肝臟組織中淀粉樣纖維沉積情況(放大倍數(shù)×400)

3 討 論

根據(jù)已有研究證實(shí)AApoA-II淀粉樣纖維可以引起小鼠系統(tǒng)性淀粉樣變，并沉積于小鼠的腦和骨髓以外的全身各器官，如肝臟，脾臟，舌等組織器官,但在骨骼肌組織中是否存在AApoAII纖維，尚未有相關(guān)報(bào)道。

目前，已有研究顯示在患有慢性消耗性疾病的鹿和散發(fā)性Creutzfeldt-Jakob病患者的骨骼肌中均有朊病毒蛋白PrPSc的表達(dá)[12]。此外，患有AA amyloidosis的牛的骨骼肌中也發(fā)現(xiàn)有AA淀粉樣纖維的存在[13]。本研究首次發(fā)現(xiàn)apoA-II mRNA在小鼠肱三頭肌、股四頭肌、豎脊肌、胸大肌中均有表達(dá)，其表達(dá)量低于肝臟中的表達(dá)量(圖1)，Western blot技術(shù)同樣檢測(cè)到4個(gè)部位的骨骼肌中存在AApoAII淀粉樣纖維，但在4個(gè)部位骨骼肌的沉積程度不盡相同，分別為胸大肌>豎脊肌>肱三頭肌>股四頭肌(圖2)，可能與各部位的骨骼肌功能狀態(tài)和血液供應(yīng)相關(guān)。我們的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，由前體蛋白apoA-II通過(guò)蛋白變構(gòu)所形成的AApoAII纖維主要沉積于骨骼肌組織的血管壁和肌纖維間質(zhì)中，而在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)和神經(jīng)纖維中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(圖3, 4)。此外，骨骼肌中提取的AApoAII纖維成分，可以誘發(fā)淀粉樣變二次傳播實(shí)驗(yàn)(圖5,6，表1)。

表1 肌肉組織中提取的淀粉樣纖維進(jìn)行二次傳播實(shí)驗(yàn)情況

目前研究證實(shí)，作為人類食物主要來(lái)源的動(dòng)物肌肉，可以傳播傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy, TSE )[10]；在小鼠、倉(cāng)鼠和羊的骨骼肌中高表達(dá)的朊蛋白(PrPC)可作為朊病毒(PrPSc)復(fù)制的底物；大量沉積于鹿的骨骼肌中的朊病毒則可導(dǎo)致慢性消耗性疾?。怀练e于人類骨骼肌中的朊病毒PrPSc可以誘發(fā)散發(fā)性Creutzfeldt-Jacob 病(CJD)。此外，日本的研究人員通過(guò)對(duì)高齡牛的骨骼肌檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)炎癥相關(guān)淀粉樣蛋白A(AA)同樣具有與朊病毒相似的以肌肉為媒介的傳播特性[11]。因此，以上研究均支持AApoAII通過(guò)骨骼肌進(jìn)行傳播的觀點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn), AApoAII淀粉樣纖維可通過(guò)唾液、 乳汁、糞便等媒介進(jìn)行種間傳播，而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了AApoAII淀粉樣纖維可沉積于肌肉組織中，并且可通過(guò)肌肉組織進(jìn)行二次傳播。

綜上所述，存在于人類、小鼠、大鼠和魚類血清中的apoA-II，可以誘發(fā)小鼠老化淀粉樣變，并且以骨骼肌為媒介而傳播的可能性是存在的，進(jìn)一步闡明了淀粉樣變疾病的發(fā)病機(jī)制，并且對(duì)此類疾病的治療和預(yù)防方法的研發(fā)提供了新的有效的理論實(shí)驗(yàn)支持。

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