黃 芳

結(jié)締組織生長因子(CTGF)是CCN家族成員之一[1]。CTGF是一個(gè)富含有半胱氨的分泌蛋白，與細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)，并且可以與多個(gè)整合素相互作用[2-3]。最近的研究表明，CTGF在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中也起著重要作用[4-5]。本研究應(yīng)用pcDNA3.1CTGF過表達(dá)載體及siRNA干擾方法，轉(zhuǎn)染人食管癌Eca109細(xì)胞，分別增加細(xì)胞CTGF的表達(dá)及抑制內(nèi)源的CTGF的表達(dá)，并用INF-γ處理，觀察其對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

30例食管癌標(biāo)本取自2009年無錫市第一人民醫(yī)院胸外科，所有病例均病理檢查證實(shí)，取癌旁組織為正常對(duì)照。培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系Eca109使用RPMI 1640培養(yǎng)基，其含有10%FBS，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

1.2 CTGF過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及小RNA(siRNA)干擾

通過RT-PCR獲得編碼CTGF全長的cDNA。PCR產(chǎn)物用含有1%EB的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，在紫外線下進(jìn)行切膠純化。在構(gòu)建Eca109穩(wěn)定的細(xì)胞株時(shí)，應(yīng)用Lipofectamin的轉(zhuǎn)染試劑將CTGF表達(dá)載體和對(duì)照載體轉(zhuǎn)染Eca109，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。最后用600 μg/μl的G418篩選2周，得到克隆后采用Western Blot進(jìn)行鑒定。

1.3 RNA制備及Real-Time PCR分析

組織標(biāo)本及細(xì)胞的RNA采用前述方法進(jìn)行制備。用于Real -Time PCR檢測(cè)的CTGF引物。并以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。本研究所有的反應(yīng)均為一式三份，并在iCycler iQ system(Bio-Red)上進(jìn)行反應(yīng)。所有引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均要進(jìn)行溶解曲線和DNA凝膠電泳分析。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色采用Envision兩步法進(jìn)行。食管癌標(biāo)本和癌旁組織用中性福爾馬林液固定，并進(jìn)行石蠟包埋，包埋后5 μm連續(xù)切片，并嚴(yán)格按Envision兩步法試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 Western Blot 分析

當(dāng)細(xì)胞長至80%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞收集，并應(yīng)用PBS清洗2次，之后應(yīng)用RIPA Buffer于冰上裂解15 min，然后于4℃下離心細(xì)胞裂解液15 min，并用Bradford試劑測(cè)定存在的蛋白濃度，然后取等量的蛋白樣品加入6×SDS-PAGE樣品緩沖液，并煮沸5 min，變性后進(jìn)行10%PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜及顯色。其一抗是鼠抗CTGF單抗，二抗是由HRP標(biāo)記的鼠抗IgG。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。采用單因素方差分析的方法進(jìn)行各組間的比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CTGF在食管癌的標(biāo)本中表達(dá)情況

從15例患者的快速冷凍食管癌標(biāo)本中提取RNA。與癌旁組織相比，CTGF mRNA在73.3%(22/30)食管癌的標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)。經(jīng)單變量的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，兩組CTGF mRNA的表達(dá)水平存在差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western Blot檢測(cè)在配對(duì)的癌旁組織和癌組織中CTGF蛋白表達(dá)水平與Real-Time PCR檢測(cè)的CTGF mRNA表達(dá)水平一致。免疫組化染色結(jié)果顯示，癌旁組織中CTGF表達(dá)很弱，在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。

2.2 過表達(dá)CTGF抑制食管癌細(xì)胞的凋亡

構(gòu)建CTGF表達(dá)的食管癌Eca109細(xì)胞穩(wěn)定株，并檢測(cè)了轉(zhuǎn)染穩(wěn)定株中CTGF蛋白表達(dá)水平，并選擇了兩個(gè)不同表達(dá)水平的克隆，分別命名為Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M)，對(duì)照組細(xì)胞命名為Eca109/C。在CTGF過表達(dá)的Eca109穩(wěn)定菌株中，CTGF蛋白水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞水平。

應(yīng)用IFN-γ(500 U/ml)處理細(xì)胞24 h后并檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況相比，Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別下降11.95%和4.22%。在IFN-γ處理后，Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組中Bcl-XL蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。

2.3 CTGF siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CTGF表達(dá)水平

在CTGF siRNA轉(zhuǎn)染的Eca109細(xì)胞中，CTGF蛋白水平明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(CTGF siRNA C)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CTGF siRNA組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯上升(10.16% vs 18.76%)。在IFN-γ處理后，CTGF siRNA組中Bcl-XL蛋白水平低于對(duì)照組。

3 討論

CTGF在創(chuàng)傷修復(fù)及纖維化疾病中起重要作用，但是CTGF在腫瘤的發(fā)展、演進(jìn)[6-7]及腫瘤細(xì)胞的存活中也有重要作用[8]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，CTGF 在人食管癌的標(biāo)本中高表達(dá)。

細(xì)胞凋亡不僅和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及退化有著密切的聯(lián)系，而且是治療腫瘤的主要目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)細(xì)胞中CTGF后，用INF-γ處理，可明顯增加其對(duì)INF-γ誘導(dǎo)的凋亡的抵抗性；下調(diào)CTGF后，其對(duì)INF-γ處理誘導(dǎo)的凋亡抗性明顯降低，提示CTGF可能是通過抑制凋亡增加藥物抵抗性。

為了探討CTGF增加細(xì)胞凋亡抗性的機(jī)制，我們研究了上調(diào)CTGF表達(dá)及下調(diào)CTGF表達(dá)，分別用INF-γ處理后，兩組細(xì)胞與其對(duì)照組細(xì)胞相比抗凋亡蛋白Bcl-XL蛋白表達(dá)情況。上調(diào)CTGF后，對(duì)于凋亡的抑制伴有Bcl-XL蛋白表達(dá)的增加；下調(diào)CTGF后，其對(duì)INF-γ誘導(dǎo)凋亡的抵抗性減弱同時(shí)伴有Bcl-XL的表達(dá)下調(diào)。CTGF表達(dá)增加和減少分別導(dǎo)致特異性的Bcl-XL蛋白表達(dá)的增加和降低，提示Bcl-XL在CTGF誘導(dǎo)的凋亡中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示用IFN-γ(500 U/ml)處理細(xì)胞24 h后并且檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞分析顯示，和Eca109/C組相比，Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降(11.95%vs 4.22%)。為了研究CTGF對(duì)于IFN-γ介導(dǎo)的凋亡對(duì)抗作用的機(jī)制，我們檢測(cè)了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)水平變化。在IFN-γ處理后，Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M)中，Bcl-XL蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。

本研究為了研究內(nèi)源性的CTGF是否在食管癌細(xì)胞中凋亡抵抗起作用，我們用RNAi 介導(dǎo)的慢病毒載體下調(diào)Eca109中CTGF的基礎(chǔ)表達(dá)水平。為了檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染是否有效的阻斷了內(nèi)源的CTGF的表達(dá)，我們檢測(cè)了CTGF siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CTGF的表達(dá)水平。在CTGF siRNA轉(zhuǎn)染的Eca109細(xì)胞中，CTGF蛋白水平明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(CTGF siRNA C)。接下來我們研究干擾CTGF基礎(chǔ)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡抵抗的影響。用IFN-γ (500 U /ml)處理細(xì)胞24 h并且檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞分析顯示，和CTGF siRNA C組相比，CTGF siRNA組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯上升。

本研究為了進(jìn)一步檢測(cè)CTGF siRNA組凋亡指數(shù)的上升是否同樣與抗凋亡蛋白Bcl-XL相關(guān)，我們檢測(cè)了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)水平變化。在IFN-γ處理后，CTGF siRNA組中，Bcl-XL蛋白水平低于對(duì)照組。Bcl-XL對(duì)傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的具有化療抵抗作用最先見于在表達(dá)Erb-B2的乳腺癌細(xì)胞中Bcl-XL表達(dá)上調(diào)，同時(shí)對(duì)三苯氧胺誘導(dǎo)的凋亡有抵抗性[9]。CTGF誘導(dǎo)Bcl-XL的上調(diào)與以前的研究結(jié)果一致：在乳腺癌中，CTGF的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，并且增加了乳腺癌細(xì)胞的遷移[10]。

以上結(jié)果表明，CTGF可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡抵抗性，該作用與上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-XL有關(guān)。由于在標(biāo)本及細(xì)胞中CTGF過表達(dá)與其對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用一致，CTGF可以看做是食管癌化療敏感性中一個(gè)重要決定因素。因此，其可能是食管癌一個(gè)新的化療敏感性預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且可能是一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)。

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