王海濤，方以群

氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)是過(guò)敏性哮喘的顯著特點(diǎn)，可直接導(dǎo)致哮喘患者氣管平滑肌和支氣管發(fā)生過(guò)度收縮，引發(fā)一系列以小支氣管明顯痙攣收縮為特征的臨床病癥［1］。主要堿性蛋白(major basic protein，MBP)是一種活化嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)脫顆粒產(chǎn)生的低分子量、高陽(yáng)離子蛋白，是包括支氣管哮喘在內(nèi)的多種氣道炎癥性疾病的主要標(biāo)志物之一［2］。MBP能夠通過(guò)抑制神經(jīng)元M2型毒蕈堿受體(muscarinic M2receptor，M2R)功能，引發(fā)大量乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)的釋放，導(dǎo)致支氣管收縮和AHR。本綜述對(duì)MBP結(jié)構(gòu)、功能作用及其與AHR的關(guān)系等的研究情況進(jìn)行介紹。

1 MBP的結(jié)構(gòu)

MBP不僅存在于EOS，而且在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞內(nèi)也有一定表達(dá)。人類MBP基因序列定位在11號(hào)染色體，人類MBP與豚鼠MBP抗血清存在交叉反應(yīng)性，兩者的單克隆抗體也存在＞86%的交叉反應(yīng)性。

MBP是一個(gè)序列特征不顯著的C型凝集素(CTL)超家族成員。人MBP包含117個(gè)氨基酸殘基，其中有17個(gè)精氨酸殘基和7個(gè)賴氨酸殘基，還含有9個(gè)半胱氨酸殘基［3］。MBP最初是以1個(gè)含222個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白形式(pro-MBP)合成的，包含1個(gè)16-氨基酸殘基信號(hào)肽、89個(gè)氨基酸殘基前體片段和含117個(gè)氨基酸殘基。在pro-MBP胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至進(jìn)行蛋白酶解加工過(guò)程和MBP儲(chǔ)存在EOS顆粒期間，強(qiáng)酸性前體片段發(fā)揮了中和基本MBP結(jié)構(gòu)域作用的效能。第1基因座控制區(qū)(pro-MBP 123～150氨基酸殘基)主要有顯著細(xì)胞毒性;第2基因座控制區(qū)(pro-MBP 194～222氨基酸殘基)在促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺方面更具高效性［4］。pro-MBP在細(xì)胞質(zhì)顆粒中水解生成14 kD MBP，儲(chǔ)存在EOS分泌性“特異”顆粒的高電子密度的結(jié)晶核心。EOS活化后，MBP被分泌到分泌小泡，逐步以脫顆粒的形式釋放［5］。

2 MBP對(duì)呼吸系統(tǒng)的病理生理作用

MBP對(duì)腫瘤細(xì)胞及脾臟、腸道、內(nèi)皮細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等哺乳動(dòng)物的多種細(xì)胞有毒性作用。MBP能激活組胺釋放和減弱細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)炎癥進(jìn)程。MBP能夠引發(fā)氣道上皮細(xì)胞損傷，增加氣道上皮細(xì)胞前列腺素合成，誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放組胺，介導(dǎo)氣道平滑肌收縮，加速氣道水腫發(fā)生，提高氣道對(duì)致痙原的反應(yīng)性等。Kato等［6］的研究表明，MBP可損傷呼吸道合胞體病毒感染的支氣管上皮細(xì)胞，說(shuō)明MBP與呼吸道合胞體病毒感染誘發(fā)的哮喘急性加重有關(guān)。

MBP是M2R選擇性、內(nèi)源性變構(gòu)拮抗劑。肺臟含有M2R、M3型毒蕈堿受體(M3R)等多種亞型毒蕈堿受體。肺的副交感神經(jīng)末稍釋放的ACh激活M3R，作用于氣道平滑肌，引發(fā)其收縮，導(dǎo)致支氣管收縮。同時(shí)，副交感神經(jīng)的ACh釋放到神經(jīng)末梢時(shí)會(huì)受到M2R的抑制作用。應(yīng)用選擇性拮抗劑阻斷神經(jīng)性M2R的負(fù)反饋抑制作用，可8～10倍地增大電刺激迷走神經(jīng)引發(fā)的支氣管收縮效果。相反，應(yīng)用毛果蕓香堿興奮M2R可降低上述效果的80%［7］。MBP能夠顯著增強(qiáng)肺C纖維對(duì)于肺膨脹和化學(xué)性刺激的敏感性。C型輸入神經(jīng)纖維激活后，輸入感受器編碼以動(dòng)作電位形式的神經(jīng)沖動(dòng)傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)肺化學(xué)反射(包括呼吸暫停、心動(dòng)過(guò)緩和低血壓)和其他諸如支氣管收縮、支氣管血管舒張、呼吸困難和咳嗽等心肺反射［2］。MBP通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)向電流及動(dòng)作電位的途徑對(duì)肺感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)揮直接的電荷依賴的長(zhǎng)效致敏效應(yīng)，導(dǎo)致在病理生理?xiàng)l件下發(fā)生與EOS氣道滲入有關(guān)的AHR。75%迷走神經(jīng)的支氣管肺傳入纖維是無(wú)髓鞘(C類)纖維，興奮后能引發(fā)支氣管收縮、黏液分泌過(guò)多及其他由膽堿能反射和內(nèi)源性速激肽類介導(dǎo)的對(duì)氣道功能的影響［8］。MBP可引起肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺、活化嗜中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，直接與哮喘的上皮細(xì)胞損害、支氣管痙攣等相關(guān)。向猴子肺內(nèi)灌注MBP，除了可引起支氣管痙攣外，還可使支氣管高反應(yīng)性增高10倍［9］。另外，MBP還可通過(guò)蛋白激酶C和細(xì)胞內(nèi)Ca2+介導(dǎo)II型肺泡壁細(xì)胞對(duì)磷脂酰膽堿的分泌［10］。

3 MBP表達(dá)的影響因素

MBP mRNA的表達(dá)水平隨著EOS的發(fā)育而逐步增加，隨著EOS的成熟而減少。EOS始于造血干細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞的分化過(guò)程，最初受白細(xì)胞介素3(IL-3)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5的調(diào)控;隨后，IL-5特異地影響EOS的終末分化、功能激活等。

EOS經(jīng)CC-基序趨化因子受體3(CCR3)激動(dòng)劑募集到氣道神經(jīng)周圍及經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞黏附分子1(ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子(VCAM)黏附到氣道神經(jīng)上，通過(guò)鈣內(nèi)流、增加CD11和CD18表達(dá)、活化ERK和p38 MAPK、增加生成活性氧、肌動(dòng)蛋白聚合和脫顆粒及EOS活化趨化因子、P物質(zhì)、ICAM-1和VCAM等激活EOS，釋放MBP。除EOS活化趨化因子外，EOS活化趨化因子-2，-3、單核細(xì)胞趨化蛋白-2，-3，-4、RANTES、CCL15和CCL28等與CCR3結(jié)合的趨化因子也可能參與了對(duì)EOS的激活過(guò)程［11］。

ICAM-1和EOS活化趨化因子是EOS化學(xué)誘導(dǎo)至神經(jīng)的關(guān)鍵因子。TNF-α能上調(diào)EOS活化趨化因子和ICAM-1的表達(dá)，還能增加 IL-5的表達(dá)和降低 M2R mRNA穩(wěn)定性。TNF-ɑ可能間接增加EOS增殖，遷移和黏附到副交感神經(jīng)上，促進(jìn)EOS募集反應(yīng)，增加生成MBP，抑制M2R功能［12］。

另外，GM-CSF、IL-1、IL-3、IL-5可能對(duì)EOS有不同程度的活化作用。Meyts等［13］研究顯示，IL-12抗體可降低支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中CD4+T細(xì)胞數(shù)量和IL-4、IL-5、IL-13水平及肺IL-10、EOS活化趨化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平;在氣道激發(fā)階段通過(guò)干擾素 γ介導(dǎo)，減低 EOS活化趨化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平，說(shuō)明IL-12很可能通過(guò)上述細(xì)胞因子影響MBP的生成。

除上述影響因素外，EOS顆粒發(fā)育基因(eosinophil granule ontogeny，EGO)——一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA表達(dá)基因被沉默后，MBP mRNA的表達(dá)水平僅為對(duì)照的9%，表明EGO是MBP基因正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)的一個(gè)必要因子［14］。另外，GATA-2在MBP P2啟動(dòng)子反式激活過(guò)程中充當(dāng)了GATA-1的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，也能抑制GATA-1約50%活性，發(fā)揮對(duì)MBP表達(dá)的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

4 MBP調(diào)控的細(xì)胞因子

MBP可顯著上調(diào)ET-1、TGF-ɑ、TGF-β1、EGFR、PDGF-β、MMP-9、腱糖蛋白和纖維連接蛋白的mRNA表達(dá)水平，下調(diào)MMP-1基因表達(dá)水平，促進(jìn)MMP-1、MMP-9、ET-1、PDGF-AB蛋白分子生成，在支氣管上皮修復(fù)、肺氣管結(jié)構(gòu)重塑、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞及調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞增殖、趨化、激活、細(xì)胞外基質(zhì)的更新、降解等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MBP還可與IL-1ɑ和TGF-β1協(xié)同增加IL-6類細(xì)胞因子mRNA和蛋白質(zhì)的生成量［15］。

MBP能誘導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放、EOS和成纖維細(xì)胞IL-8分泌、前列腺素和離子分泌，與哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病的介導(dǎo)機(jī)制有關(guān)。在氣道上皮細(xì)胞，MBP可增加前列腺素E2和F2ɑ的合成，減弱纖毛運(yùn)動(dòng)性，誘發(fā)細(xì)胞損傷［16］。MBP可激活上皮細(xì)胞表面的鈣感受器，促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9生成，導(dǎo)致基底細(xì)胞增生［17］。Page等［18］研究表明，MBP可有效刺激中性粒細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控IL-8的基因轉(zhuǎn)錄增加生成IL-8，導(dǎo)致急性哮喘及其他炎癥性肺疾病的發(fā)生。MBP也能短暫升高M(jìn)IP-1α和MIP-1β mRNA表達(dá)水平，但未能促進(jìn)MIP-1α或MIP-1β的蛋白生成量。

5 MBP與AHR的關(guān)系及其在病理過(guò)程中的作用

在絕大多數(shù)動(dòng)物中，氣道M2R的含量明顯高于M3R(由于動(dòng)物種系不同，M2R含量為毒蕈堿性受體總量的50%～80%)。經(jīng)檢測(cè)M2R和M3R mRNA存在于人類支氣管中［1］。M2R功能的降低與病毒感染、變應(yīng)原激發(fā)、臭氧暴露、有機(jī)磷酸鹽暴露和哮喘病理過(guò)程中發(fā)生的AHR密切相關(guān)。應(yīng)用肝素中和MBP對(duì)M2R的拮抗作用，快速恢復(fù)M2R功能可有效逆轉(zhuǎn) AHR［19］。氣管內(nèi)滴入 MBP可誘發(fā)支氣管收縮和AHR［8］。依那西普、地塞米松可通過(guò)抑制EOS募集至氣道神經(jīng)周圍，保護(hù)神經(jīng)元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR的發(fā)生［12，20］。

AHR的主要機(jī)制是MBP阻斷副交感神經(jīng)M2R對(duì)ACh釋放的抑制功能，增加釋放到氣道平滑肌上M3R的ACh量和增強(qiáng)迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮。阻斷M2R功能可5～10倍地增大迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮。EOS經(jīng)CCR3激動(dòng)劑募集到氣道神經(jīng)周圍，經(jīng)ICAM-1、VCAM黏附到氣道神經(jīng)上，釋放MBP。阻斷或抑制EOS向肺的遷移及阻斷MBP抑制功能均能有效保護(hù)M2R功能，阻止AHR發(fā)生。

在正常生理?xiàng)l件下，副交感神經(jīng)末梢對(duì)ACh的釋放受M2R抑制。ACh或毛果蕓香堿等毒蕈堿激動(dòng)劑興奮M2R，通過(guò)抑制ACh的釋放減輕迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮。相反，M2R功能的喪失或被拮抗劑阻斷將導(dǎo)致ACh釋放增多，增強(qiáng)誘發(fā)支氣管收縮。MBP抗體阻止了M2R功能障礙及其相關(guān)的AHR的發(fā)生，說(shuō)明是MBP阻遏了神經(jīng)元M2R功能，導(dǎo)致了AHR。在急性副流感病毒感染、變應(yīng)原致敏和激發(fā)及臭氧的急性暴露所導(dǎo)致的哮喘中，肺副交感神經(jīng)上的M2R均發(fā)生了功能障礙，表明M2R功能缺失是AHR重要的病理機(jī)制。MBP可阻遏M2R功能，顯著增加ACh釋放量，增大10倍迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮效果［1］。在致命性哮喘患者和變應(yīng)原激發(fā)的動(dòng)物模型的氣道神經(jīng)周圍，活化的EOS簇生成群，脫顆粒生成MBP，阻斷M2R功能消除對(duì)ACh釋放的負(fù)反饋性調(diào)控作用，增加氣道張力和增強(qiáng)迷走神經(jīng)介導(dǎo)的支氣管收縮。EOS在M2R功能缺失和繼發(fā)的AHR的病理過(guò)程中發(fā)揮了特有的作用［11］。另外，M2R還能經(jīng)活化的腺苷酸環(huán)化酶抑制平滑肌舒張，增加釋放的ACh可能進(jìn)一步增強(qiáng)M2R介導(dǎo)對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用。當(dāng)然，M2R的合成減少也可能是其功能降低的病理機(jī)制［1］。

另外，氣道平滑肌內(nèi)的M3R經(jīng)百日咳病毒毒素肺敏感性G蛋白(GTP-結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白)與磷脂酶C偶聯(lián)，激活的磷脂酶C再催化由膜磷脂磷脂酰肌醇4，5-二磷酸生成肌醇三磷酸、二酰甘油和經(jīng)激活的蛋白激酶發(fā)生蛋白質(zhì)磷酸化，也可介導(dǎo)氣道平滑肌收縮［1］。

6 結(jié)束語(yǔ)

EOS募集到氣道神經(jīng)，活化后釋放MBP，抑制M2R對(duì)副交感神經(jīng)ACh釋放的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，引起ACh釋放明顯增多，作用于氣道平滑肌上M3R，導(dǎo)致發(fā)生AHR。顯而易見(jiàn)，EOS(特別是活化的EOS)和MBP與AHR直接相關(guān)。但是，以往研究在哪些檢測(cè)指標(biāo)能較為準(zhǔn)確地反映三者之間關(guān)系的問(wèn)題上存在一定的分歧。有研究表明，在支氣管哮喘的病理生理過(guò)程中，EOS脫顆粒的意義要遠(yuǎn)大于其數(shù)量的增多［21］。AHR與BALF或氣道組織中的EOS含量沒(méi)有直接相關(guān)性，但與沉積在氣道和氣道神經(jīng)周圍的MBP和活化EOS的含量密切相關(guān)。相一致的是，Evans等［20］的研究表明，地塞米松在通過(guò)抑制EOS募集至氣道神經(jīng)周圍，保護(hù)神經(jīng)元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR發(fā)生時(shí)，并沒(méi)有引起B(yǎng)ALF中EOS含量變化。Yost等［19］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，豚鼠在臭氧暴露后，肺EOS數(shù)量在14 h開(kāi)始減少;隨后在48 h開(kāi)始明顯增多，至少維持至少4 d，說(shuō)明EOS數(shù)量并不是維持不變的，而是隨著病程演進(jìn)反復(fù)變化的。相反，Homma等［22］研究卻表明，BALF中EOS數(shù)量和MBP水平與哮喘的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。在死因?yàn)橄掷m(xù)狀態(tài)的患者中，MBP存在于受損上皮細(xì)胞的表面和氣道黏膜和黏液中，完全抑制呼吸上皮纖毛運(yùn)動(dòng)和對(duì)呼吸上皮造成毒性損害，發(fā)生AHR，表明嚴(yán)重哮喘與氣道管腔內(nèi)EOS和MBP存有重要的關(guān)聯(lián)。

筆者認(rèn)為，在研究EOS、MBP與AHR關(guān)系及其相關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病時(shí)，應(yīng)盡量以氣道黏膜、神經(jīng)周圍蛋白分子(EOS應(yīng)以在氣道神經(jīng)周圍活化的EOS作為檢測(cè)指標(biāo))及其基因表達(dá)作為主要依據(jù)，而以其在BALF、組織及血漿中的表達(dá)結(jié)果作為參考，進(jìn)行MBP相關(guān)性分子生物學(xué)功能及機(jī)制的研究，才能獲得可信度高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

［1］Fryer AD，Jacoby DB.Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle［J］.Am J Respir Crit Care Med，1998，158(Suppl 2):S154-S160.

［2］Gu Q，Lim ME，Gleich GJ，et al.Mechanisms of eosinophil major basic protein-induced hyperexcitability of vagal pulmonary chemosensitive neurons［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，296(3):L453-L461.

［3］Thomas LL，Kubo H，Loegering DJ，et al.Peptide-based analysis of amino acid sequences important to the biological activity of eosinophil granule major basic protein［J］.Immunol Lett，2001，78(3):175-181.

［4］Glerup S，Kl?verpris S，Oxvig C.The proform of the eosinophil major basic protein binds the cell surface through a site distinct from its C-type lectin ligand-binding region［J］.J Biol Chem，2006，281(42):31509-31516.

［5］Melo RC，Spencer LA，Perez SA，et al.Vesicle-mediated secretion of human eosinophil granule-derived major basic protein(MBP)［J］.Lab Invest，2009，89(7):769-781.

［6］Kato M，Ishioka T，Kita H，et al.Eosinophil granular proteins damage bronchial epithelial cells infected with respiratory syncytial virus［J］.Int Arch Allergy Immunol，2012，158(Suppl 1):11-18.

［7］Jacoby DB，Gleich GJ，F(xiàn)ryer AD，et al.Human eosinophil major basic protein is an endogenous allosteric antagonist at the inhibitory muscarinic M2receptor［J］.J Clin Invest，1993，91(4):1314-1318.

［8］Gu Q，Wiggers ME，Gleich GJ，et al.Sensitization of isolated rat vagal pulmonary sensory neurons by eosinophil-derived cationic proteins［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(4):L544-L552.

［9］Swaminathan GJ，Weaver AJ，Loegering DA，et al.Crystal structure of the eosinophil major basic protein at 1.8［J］.J Biol Chem，2001，276(28):26197-26203.

［10］Manabu O，Kai H，Shinozawa S，et al.Effects of eosinophil granule major basic protein on phosphatidylcholine secretion in rat type II pneumocytes［J］.Am J Physiol，1999，276(5Pt 1:L763-L768.

［11］Fryer AD，Stein LH，Nie Z，et al.Neuronal eotaxin and the effects of CCR3 antagonist on airway hyperreactivity and M2 receptor dysfunction［J］.J Clin Invest，2006，116(1):228-236.

［12］Nie Z，Jacoby DB，F(xiàn)ryer AD.Etanercept prevents airway hyperresponsiveness by protecting neuronal M2muscarinic receptors in antigen-challenged guinea pigs［J］.Br J Pharmacol，2009，156(1):201-210.

［13］Meyts I，Hellings PW，Hens G，et al.IL-12 Contributes to Allergen-Induced Airway Inflammation in Experimental Asthma［J］.J Immunol，2006，177(9):6460-6470.

［14］Wagner LA，Christensen CJ，Dunn DM，et al.EGO，a novel，noncoding RNA gene，regulates eosinophil granule protein transcript expression［J］.Blood，2007，109(12):5191-5198.

［15］Pe'gorier S，Wagner LA，Gleich GJ，et al.Eosinophil-derived cationic proteins activate the synthesis of remodeling factors by airway epithelial cells［J］.J Immunol，2006，177(7):4861-4869.

［16］Wylam，ME，Gungor N，Mitchell RW，et al.Eosinophils，major basic protein，and polycationic peptides augment bovine airway myocyte Ca2+mobilization［J］.Am J Physiol，1998，274(6 Pt 1):L997-L1005.

［17］Mulder DJ，Pacheco I，Hurlbut DJ，et al.FGF9-induced proliferative response to eosinophilic inflammation in oesophagitis［J］.Gut，2009，58(2):166-173.

［18］Page SM，Gleich GJ，Roebuck KA，et al.Stimulation of neutrophil interleukin-8 production by eosinophil granule major basic protein［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1999，21(2):230-237.

［19］Yost BL，Gleich GJ，Jacoby DB，et al.The changing role of eosinophils in long-term hyperreactivity following a single ozone exposure［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，289(4):L627-L635.

［20］Evans CM，Jacoby DB，F(xiàn)ryer AD.Effects of dexamethasone on antigen-induced airway eosinophilia and M Receptor dysfunction［J］.Am J Respir Crit Care Med，2001，163(6):1484-1492.

［21］Kim CK，Callaway Z，Kim DW，et al.Eosinophil degranulation is more important than eosinophilia in identifying asthma in chronic cough［J］.J Asthma，2011，48(10):994-1000.

［22］Homma T，Bates JH，Irvin CG.Airway hyperresponsiveness induced by cationic proteins in vivo:site of action［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，289(3):L413-L418.

(本文編輯:甘輝亮、莫琳芳)