樓宏強(qiáng)，胡 野，王 嵐，單小云，盛秀勝，高素華

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是引起人類急性腹瀉常見的病原體之一，是全球范圍內(nèi)重要的人獸共患細(xì)菌性腸道病原菌，其感染率在世界各地普遍呈上升趨勢?？漳c彎曲菌感染可引起人類發(fā)熱、急性腸炎和格林-巴利綜合癥(Guillain-Barrre syndrome, GBS)等，還可感染動(dòng)物導(dǎo)致牛和綿羊的流產(chǎn)，火雞的肝炎和藍(lán)冠病，童子雞和雛雞的壞死性肝炎，雛雞、犢牛、仔豬的腹瀉等多種疾病[1-2]。

空腸彎曲菌引發(fā)的食品安全和食源性疾病問題日益突出，成為公共衛(wèi)生關(guān)注的新焦點(diǎn)。通過建立快速有效的空腸彎曲菌感染檢測診斷方法，可以為空腸彎曲菌感染的防治提供重要手段。血清學(xué)檢測診斷方法以其簡便、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)在空腸彎曲菌感染檢測的研究中受到廣泛關(guān)注。而且，血清抗體的檢測結(jié)果對于空腸彎曲菌感染導(dǎo)致Guillain-Barrre綜合征的病因分析具有重要價(jià)值[3-5]。

在致病菌感染宿主的過程中，外膜蛋白通過加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對抗原的攝取，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞的活化，在免疫反應(yīng)中表現(xiàn)出重要作用，被廣泛用于病原體感染血清抗體檢測及保護(hù)性疫苗候選抗原。由于蛋白抗原通過抗原表位與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)，通過使用特異性抗原表位或表位復(fù)合物作為抗體檢測物可檢測出特異性的免疫反應(yīng)成分，避免非特異性反應(yīng)產(chǎn)物所致的假陽性與交叉反應(yīng)，從而提高診斷方法的特異性[6-8]。

空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18是由ompl8基因編碼的分子質(zhì)量為18 kD的外膜蛋白，該蛋白在彎曲菌屬中普遍存在，為空腸彎曲菌感染的血清學(xué)檢測方法建立提供了重要候選抗原[9]。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18進(jìn)行結(jié)構(gòu)和分子特征分析，對其中可能存在的線性B細(xì)胞表位進(jìn)行ELISA鑒定，以期為后續(xù)血清學(xué)檢測方法的建立提供候選抗原和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1數(shù)據(jù)庫 空腸彎曲菌全基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL111168.1)和核酸序列數(shù)據(jù)庫 GenBank/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 由美國國家生物技術(shù)信息中心構(gòu)建。蛋白序列數(shù)據(jù)庫SwissProt和TrEMBL (http://ww.expasy.org/sprot/ 和http://www.expasy.org/TrEMBL/) 由歐洲生物信息學(xué)研究所建立[10]。

1.2OMP18蛋白結(jié)構(gòu)分析 采用TMpred (Prediction of Transmembrane Regions and Orientation, www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html)和TMHMM 2.0 (http://cbs.dtu.dk/serves/ TMHMM-2.0/) 預(yù)測蛋白中可存在的跨膜結(jié)構(gòu)域；采用ProDom (http://prodes.toulouse.Inra.fr/prodom/doc/blast-form.html)和Pfam (http://plato.wustl.edu/hmmsearch.shtml)預(yù)測目的蛋白中存在的功能結(jié)構(gòu)域；通過http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/對OMP18蛋白中可能存在的線性B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測；采用DNASTAR/protean軟件對目的蛋白中存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性和抗原性進(jìn)行分析。

1.3OMP18蛋白氨基酸序列保守性分析 采用http://www.ch.embnet.org/software/BottomBLAST.html?(EMBnet-CH/SIB) (Switzerland) 數(shù)據(jù)庫對空腸彎曲菌omp18 基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對，參數(shù)選擇：Protein database，Non redundant，Blosum 62。篩選出與其相似性較高的氨基酸序列在http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 進(jìn)行同源性分析。

1.4OMP18蛋白線性B細(xì)胞表位的ELISA鑒定 OMP18線性B細(xì)胞表位多肽由上海英駿生物技術(shù)公司合成，并采用HPLC技術(shù)對合成多肽進(jìn)行純度分析。將合成的各表位多肽稀釋至10 μg/mL包被96孔板，以兔抗空腸彎曲菌全菌抗體IgG為一抗(Pierce公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體為二抗(Abcam公司)，對各表位多肽與全菌抗體的結(jié)合反應(yīng)力進(jìn)行檢測分析。

2 結(jié) 果

2.1空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18結(jié)構(gòu)分析 經(jīng)在線生物信息學(xué)軟件分析表明，空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18中不存在跨膜結(jié)構(gòu)，整個(gè)蛋白定位于菌體表面。蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)OMP18蛋白中存在OmpA結(jié)構(gòu)域，與病原菌的粘附能力密切相關(guān)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，OMP18蛋白中存在3個(gè)線性B細(xì)胞表位，且具有良好的親水性和抗原性(圖1-圖3)。

圖1空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

Fig.1TransmembranestructureanalysisoftheOMP18fromCampylobacterjejuni

2.2OMP18蛋白序列保守性研究 空腸彎曲菌omp18基因同源性比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因序列僅保守存在于不同空腸彎曲菌菌株中?？漳c彎曲菌00-2425，3488，NCTC11168，S3，IA3902，ICDCCJ07001，M1,81116,81-176，doylei269.97株中均存在omp18基因，且序列高度同源，相似度達(dá)99%(圖4)。

圖2空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18B細(xì)胞線性表位預(yù)測結(jié)果

Fig.2LineBcellepitopespredictionoftheOMP18fromCampylobacterjejuni

圖3空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18親水性、抗原性預(yù)測結(jié)果

Fig.3HydrophilicityandantigenicanalysisoftheOMP18fromCampylobacterjejuni

圖4空腸彎曲菌omp8基因核苷酸序列進(jìn)化分析

Fig.4PhylogeneticanalysisoftheCampylobacterjejunibasedontheomp18gene

2.3ELISA檢測結(jié)果 我們基于ELISA技術(shù)對預(yù)測的3個(gè)B細(xì)胞線性表位進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)表位抗原都能有效結(jié)合空腸彎曲菌全菌抗體(圖5)，其中抗原表位多肽3對抗體的親和力最強(qiáng)，為優(yōu)勢線性B細(xì)胞抗原表位。結(jié)果表明本研究所采用的預(yù)測分析方法可靠。

圖5空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18B細(xì)胞線性抗原表位ELISA篩選鑒定結(jié)果

*：與空白組和陰性組比較P<0.05

Fig.5ELISAidentificationofLinearBcellepitopesfromtheOMP18ofCampylobacterjejuni

The “*” symbol indicate a significant difference (P< 0.05), compared with the Blank and Negative control groups.

3 討 論

我國近年監(jiān)測結(jié)果表明，腹瀉患兒空腸彎曲菌檢出率為4%～17.7%，成人腹瀉檢出率為3.85%～9.61%?？漳c彎曲菌感染性腹瀉發(fā)病率在許多國家居細(xì)菌性腹瀉的首位，部分國家也僅次于志賀菌或沙門菌?？漳c彎曲菌引起的食源性感染已成為重要的公共衛(wèi)生問題。快速準(zhǔn)確地檢測空腸彎曲菌對于預(yù)防和控制空腸彎曲菌病的暴發(fā)流行，感染患者的早期治療以及嚴(yán)重并發(fā)癥的防治均有重要意義[1-2]。由于空腸彎曲菌營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)條件特殊，傳統(tǒng)的檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，國內(nèi)外學(xué)者對其檢測方法進(jìn)行了許多探索性的研究。

近年來，核酸分子雜交技術(shù)和PCR等分子生物學(xué)檢測方法取得了很大進(jìn)展，國內(nèi)外已先后開展了一些針對空腸彎曲菌的基因檢測，針對的靶基因主要包括16SrDNA、3SrDNA、hipO、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)等?；赑CR擴(kuò)增技術(shù)的檢測方法建立，為核酸水平檢測空腸彎曲菌提供了快速而有效的手段。血清學(xué)檢測診斷方法以其簡便、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)在空腸彎曲菌感染檢測的研究中也受到廣泛的關(guān)注。而且，血清抗體的檢測對于空腸彎曲菌感染導(dǎo)致Guillain-Barrre綜合征的病因分析具有重要價(jià)值[11-13]。

外膜蛋白通過加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對抗原的攝取，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活化，在免疫反應(yīng)中表現(xiàn)出重要作用，被廣泛用于病原體感染血清抗體檢測并作為保護(hù)性疫苗候選抗原[14]。如從痢疾志賀氏菌I型中提純的OMP免疫小白鼠可產(chǎn)生抗體，經(jīng)ELISA檢測，該抗體不僅可與該菌OMP產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)，而且能與痢疾志賀氏菌的整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。Zhang等從空腸彎曲菌ATCC29428株中克隆到1個(gè)編碼18 kd外膜蛋白(OMP18)的基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。通過對空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18序列進(jìn)一步分析和研究，我們發(fā)現(xiàn)其含有一個(gè)由165個(gè)氨基酸組成的開放閱讀框，序列比對結(jié)果顯示各空腸彎曲菌OMP18氨基酸序列同源性達(dá)95%以上，保守存在于各菌株中。因此，可以為血清學(xué)檢測提供有效的抗原。

OMP18蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)菌外表面，存在3個(gè)明顯的B細(xì)胞線性表位，且具有顯著的抗原性。基于ELISA技術(shù)，采用空腸彎曲菌全菌抗體對預(yù)測表位進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)3個(gè)表位多肽都能與全菌抗體有效結(jié)合，但結(jié)合力存在差異。這說明本研究所使用的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)可靠，在表位預(yù)測方面準(zhǔn)確率很高，也可用于其它蛋白的分析和研究。ELISA技術(shù)可以有效用于抗原表位的篩選，為本研究中優(yōu)勢表位的篩選鑒定提供了重要手段。

綜上所述，本研究基于空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，線性B細(xì)胞抗原表位預(yù)測及序列同源性比對等生物信息學(xué)分析，通過ELISA技術(shù)對優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行篩選鑒定，為后續(xù)空腸彎曲菌感染的血清學(xué)方法建立及疫苗研發(fā)提供候選抗原，也為其它相關(guān)研究提供了有效的科研思路，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。

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